猪流感病毒基质蛋白M2e与Fc基因融合重组乳酸菌的制备及其免疫效果研究

发布时间：2018-04-07 15:52

本文选题：猪流感　切入点：乳酸菌　出处：《吉林农业大学》2015年硕士论文

【摘要】：猪流感(Swine influenza,SI)是全球范围内广为流行的动物传染病之一,近几年来在我国各地发病较为常见,给我国的养殖业造成了十分重大的经济损失。研究表明乳酸菌能特异性表达外源目的蛋白,是一种极具应用潜力的多功能型微生态制剂。其特有的安全性、低成本和易培养等优点也昭示着它作为基因工程疫苗表达载体所具有的重要研究价值。本试验选用乳酸菌作为外源蛋白的递送载体,将猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)主要保护性抗原M2e蛋白基因与小鼠的IgG的Fc受体片段基因融合在一起,将外源基因的特异性免疫及乳酸菌的益生功能集合于一身,研制Fc融合M2e基因的重组乳酸菌口服疫苗并对其免疫效果进行初步检测及分析。研究内容及结果如下:(1)重组乳酸菌的构建、表达及免疫原性分析实验方法:通过合成、酶切、回收等方法制备包含融合基因的四组重组质粒,分别为质粒pSIP409、质粒pSIP409-3M2e、质粒pSIP409-3M2e-Fc(Fc未突变)、质粒pSIP409-3M2e-Fc(Fc已突变)。然后将重组质粒转化入大肠杆菌感受态中大量复制,采用双酶切等方法进行鉴定,运用电转化技术将重组质粒转入植物乳杆菌中并经诱导肽(SppIP)诱导获得表达,利用SDS-PAGE、Western blotting进一步检测外源目的基因在乳酸菌中的表达,结果显示重组蛋白pSIP409-3M2e、pSIP409-3M2e-Fc(Fc未突变)和pSIP409-3M2e-Fc(Fc已突变),以及所表达的蛋白均具有反应原性,为构建SIV重组乳酸菌口服制剂奠定基础。实验结果:通过上述方法成功制备重组乳酸菌,经酶切检验结果完全正确,且重组乳酸菌所表达的蛋白均具有反应原性,为进一步实验奠定了坚实的基础。(2)重组乳酸菌pSIP409-3M2e-Fc免疫保护效果的检测实验方法:将已成功制备的四组重组乳酸菌复苏,并加入诱导剂,诱导蛋白的表达,随后利用小鼠灌胃器通过灌胃的方式对小鼠进行初次免疫和加强免疫。初次免疫时间为第1天、第3天、第5天,加强免疫时间为第26天、28天、第30天。加强免疫后一周左右通过流式细胞术检测各组小鼠肠系膜淋巴结和潘氏小结中CD95+PNA+的数量变化情况以及肠系膜淋巴结和潘氏小结中B220+IgA+的数量变化情况,这些指标指示着B细胞的活化情况,从而可以通过这些指标的变化来鉴定重组乳酸菌对小鼠的免疫效果。并利用ELISA试剂盒检测各组小鼠血液中IL-4和IFN-γ的分泌情况。初次免疫和加强免疫后一周分别收取各组小鼠的粪便,并用ELISA试剂盒检测小鼠分泌型免疫球蛋白A(SIgA)的表达水平。小鼠加强免疫后一周后腹腔麻醉小鼠,随后通过滴鼻给毒,包括猪流感H9N2和H1N1,选用两种病毒是为了证明M2e保守基因在不同亚型之间的保守性。给毒后观察小鼠的精神状态并记录小鼠的体重变化,攻毒后14天眼球采血,利用ELISA试剂盒检测各组小鼠血液中IL-4和IFN-γ的分泌情况。并分析免疫后和攻毒后各组IL-4和IFN-γ的分泌情况的变化。从而进一步验证重组乳酸菌对小鼠的免疫保护效果。实验结果:与PBS组相比,免疫重组乳酸菌pSIP409-3M2e-Fc(Fc未突变)和pSIP409-3M2e-Fc(Fc已突变)以及pSIP409-3M2e后小鼠肠系膜淋巴结和潘氏小结的CD95+PNA+B220+IgA+指标均明显提高,并且SIgA的表达水平也明显增加。且免疫后与攻毒后相比,IL-4的表达量有所下降,而IFN-γ的表达量有所上升。通过指标监测,精神状态观察等结果证实了pSIP409-3M2e-Fc(Fc未突变)和pSIP409-3M2e-Fc(Fc已突变)以及pSIP409-3M2e对不同亚型流感病毒均有保护作用,且融合了未突变的Fc基因的重组乳酸菌免疫保护效果更好。结论:综合来看本试验结果证明了pSIP409-3M2e-Fc(Fc未突变)组免疫保护性优于pSIP409-3M2e-Fc(Fc已突变)组及pSIP409-3M2e组,且其免疫水平均高于其它对照组,说明Fc作为一种佐剂具有增强疫苗免疫效果的作用,同时表明基因融合重组乳酸菌具有抵抗SIV攻击的能力,为免疫增强型猪流感基因工程乳酸菌口服疫苗的研制提供了理论依据。
[Abstract]:The recombinant plasmids pSIP409 , pSIP409 - 3M2e , pSIP409 - 3M2e - Fc ( Fc had been mutated ) were synthesized . The results showed that the recombinant plasmid pSIP409 - 3M2e , pSIP409 - 3M2e - Fc ( Fc non - mutated ) and pSIP409 - 3M2e - Fc ( Fc had been mutated ) . The results showed that the recombinant plasmid pSIP409 - 3M2e , pSIP409 - 3M2e - Fc ( Fc non - mutated ) and pSIP409 - 3M2e - Fc ( Fc had been mutated ) . ( 2 ) The immune protective effect of recombinant lactic acid bacteria pSIP409 - 3M2e - Fc was detected by using ELISA kit to detect the secretion of IL - 4 and IFN - 纬 in mice .

【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S855.3

【参考文献】