普罗布考对苯妥英钠引起的昆明小鼠海马、小脑神经细胞凋亡的影响

发布时间：2018-04-07 16:35

本文选题：苯妥英钠　切入点：普罗布考　出处：《河北医科大学》2014年硕士论文

【摘要】：目的：癫痫是最常见而严重的神经系统疾病之一，患者多需终生服药。苯妥英钠从1938年开始用于抗癫痫治疗,其作用是阻止痫性放电向周围正常组织扩散，对全面性强直阵挛性发作、强直发作及部分性发作效果较好，但其治疗窗窄易出现中毒反应。长期大剂量服用和高血药浓度时易出现小脑损害症状，可能与促进小脑颗粒细胞及浦肯野细胞凋亡有关。普罗布考具有调脂、抗炎、抗氧化等作用，近年来研究表明其在神经系统也有抗氧化作用，从而发挥其神经保护作用，但其是否会对细胞凋亡产生影响仍有待于进一步研究。本实验主要通过研究普罗布考及苯妥英钠对小鼠海马、小脑神经细胞凋亡的影响，探讨苯妥英钠的神经系统不良反应及普罗布考是否具有神经保护作用。方法： 1分组及给药：清洁级健康4周龄雄性昆明小鼠50只，重量为（22±2g），随机分为NS（生理盐水）组、PHT（苯妥英钠）组和PHT+PB（普罗布考）混合组。NS组、PHT组每组各10只；PHT+PB混合组30只，按PB剂量分低、中、高剂量3个亚组，各亚组10只。采用自制灌胃针进行灌胃，具体剂量为PHT组给予100mg/(kg.d)进行药物干预；PHT+PB低、中、高剂量混合组均给与PHT100mg/(kg.d)，分别给予PB250mg/(kg.d)、500mg/(kg.d)、1000mg/(kg.d)；NS组给予等量生理盐水，混合剂量组两次给药间隔为30min；以上各组每天药物干预1次；共10天。 2取材及检测：各组小鼠用10%水合氯醛(0.35ml/100g)麻醉，仰卧固定，剪开胸腔，暴露心脏，从心尖处插入灌注针，同时从右心耳处剪开心脏放血。先快速以0.9%生理盐水冲洗（50-100ml),再用200ml4%多聚甲醛磷酸缓冲液固定。注射完毕后立即断头，迅速取出其大脑和小脑，放入4%的多聚甲醛固定，常规乙醇梯度脱水，二甲苯透明，浸腊，包埋，选取大脑和小脑连续冠状切片。通过免疫组化检测各组神经元细胞Bax、Bcl-2蛋白阳性表达情况并以AO值表示各组结果；通过TUNEL检测各组神经元凋亡情况并以细胞凋亡率表示各组结果。 3统计分析：通过SPSS13.0统计软件进行数据分析，本实验为完全随机设计资料的多个样本均数比较的方差分析，组间均数比较使用SNK-q检验。结果： 1HE染色： 1.1海马神经元HE染色：NS组细胞排列整齐，轮廓清晰完整，胞浆透明，胞核圆形或椭圆形，核仁清晰，形态正常，未见明显细胞凋亡。PHT组神经元细胞排列散乱，细胞间距增大、轮廓模糊，胞核固缩深染及周围空泡形成。PHT+PB低剂量混合组海马神经元排列疏松，凋亡细胞数较多。PHT+PB高剂量混合组神经元排列尚整齐，周围散在凋亡细胞。PHT+PB中剂量混合组细胞凋亡情况介于PHT+PB高剂量组与PHT+PB低剂量组之间。 1.2小脑神经元HE染色：NS组细胞轮廓清晰完整，胞浆透明，形态正常，偶见凋亡细胞；PHT组及PHT+PB低剂量混合组细胞排列疏松，可见大量凋亡细胞；PHT+PB高剂量混合组可见散在凋亡细胞；PHT+PB中剂量混合组细胞凋亡情况介于PHT+PB高剂量组与PHT+PB低剂量组之间。 2Bax、Bcl-2蛋白表达： 2.1Bax蛋白表达促凋亡蛋白Bax的阳性表达为细胞胞浆呈黄褐色。海马神经元：NS组偶有表达；PHT+PB低、中、高剂量混合组促凋亡蛋白Bax阳性表达细胞依次递减；PHT+PB低剂量混合组阳性细胞聚集分布；PHT+PB高剂量混合组阳性细胞散在分布；PHT+PB中剂量混合组阳性细胞分布介于以上二者之间；PHT组阳性细胞表达数最多。通过统计阳性细胞的平均光度值（AO值），进行统计学分析得出：不同处理组对促凋亡蛋白Bax阳性细胞的平均光度值有影响；进行组间分析得出：NS组与PHT组Bax阳性细胞平均光度值有差别（P0.05),PHT组与PHT+PB低剂量混合组Bax阳性细胞平均光度值无差别（P0.05)，PHT组与PHT+PB中剂量混合组Bax阳性细胞平均光度值有差别（P0.05)，PHT组与PHT+PB高剂量混合组Bax阳性细胞平均光度值有差别（P0.05)，PHT+PB中剂量混合组与PHT+PB高剂量混合组Bax阳性细胞平均光度值有差别（P0.05)。小脑神经元：NS组偶有Bax蛋白阳性表达细胞；PHT+PB低剂量混合组阳性细胞大量表达；PHT+PB高剂量混合组阳性细胞散在分布；PHT+PB中剂量混合组阳性细胞分布介于以上二者之间；PHT组阳性细胞表达数最多，着色最强。通过统计阳性细胞AO值进行统计学分析得出：不同处理组对促凋亡蛋白Bax阳性细胞的平均光度值有影响；进行组间分析得出：NS组与PHT组Bax阳性细胞平均光度值有差别（P0.05),PHT组与PHT+PB低剂量混合组Bax阳性细胞平均光度值无差别（P0.05)，PHT组与PHT+PB中剂量混合组Bax阳性细胞平均光度值有差别（P0.05)，PHT组与PHT+PB高剂量混合组Bax阳性细胞平均光度值有差别（P0.05)，PHT+PB中剂量混合组与PHT+PB高剂量混合组Bax阳性细胞平均光度值有差别（P0.05)。 2.2Bcl-2蛋白表达抗凋亡蛋白Bcl-2的阳性表达为细胞胞浆核膜出现重染棕黄色颗粒。海马神经元：NS组细胞表达明显；PHT及PHT+PB低剂量混合组少量表达；PHT+PB中剂量混合组表达增多；PHT+PB高剂量混合组明显表达；对Bcl-2阳性细胞的AO值进行统计分析得出：不同处理组对抗凋亡蛋白Bcl-2阳性细胞的平均光度值有影响；进行组间分析得出：NS组与PHT组Bcl-2阳性细胞平均光度值有差别（P0.05),PHT组与PHT+PB低剂量混合组Bcl-2阳性细胞平均光度值无差别（P0.05)，PHT组与PHT+PB中剂量混合组Bcl-2阳性细胞平均光度值有差别（P0.05)，PHT组与PHT+PB高剂量混合组Bcl-2阳性细胞平均光度值有差别（P0.05)，PHT+PB中剂量混合组与PHT+PB高剂量混合组Bcl-2阳性细胞平均光度值有差别（P0.05)。小脑神经元：NS组表达明显；PHT及PHT+PB低剂量混合组少量表达；PHT+PB中剂量混合组表达增多；PHT+PB高剂量混合组明显表达；对Bcl-2阳性细胞的AO值进行统计分析得出：不同处理组对抗凋亡蛋白Bcl-2阳性细胞的平均光度值有影响；进行组间分析得出：NS组与PHT组Bcl-2阳性细胞平均光度值有差别（P0.05),PHT组与PHT+PB低剂量混合组Bcl-2阳性细胞平均光度值无差别（P0.05)，PHT组与PHT+PB中剂量混合组Bcl-2阳性细胞平均光度值有差别（P0.05)，PHT组与PHT+PB高剂量混合组Bcl-2阳性细胞平均光度值有差别（P0.05)，，PHT+PB中剂量混合组与PHT+PB高剂量混合组Bcl-2阳性细胞平均光度值有差别（P0.05)。 3TUNEL法检测结果 TUNEL阳性细胞表现为胞核固缩，其内出现棕黄色颗粒或团块。海马和小脑神经元细胞凋亡情况：NS组偶见细胞凋亡，细胞之间排列规律整齐；PHT组可见细胞排列紊乱，大量凋亡细胞出现；PHT+PB低剂量混合组可见大量凋亡细胞，细胞体积缩小，形状不规则；PHT+PB中剂量混合组可见较多凋亡细胞聚集；PHT+PB高剂量混合组凋亡细胞散在分布。通过计数各组TUNEL阳性细胞数，计算细胞凋亡率（%），进行统计学分析得出：海马神经元：不同处理组对海马神经元细胞平均凋亡率有影响；进行组间分析得出：NS组与PHT组海马神经元细胞平均凋亡率有差别（P0.05),PHT组与PHT+PB低剂量混合组海马神经元细胞平均凋亡率无差别（P0.05)，PHT组与PHT+PB中剂量混合组海马神经元细胞平均凋亡率有差别（P0.05)，PHT组与PHT+PB高剂量混合组海马神经元细胞平均凋亡率有差别（P0.05)，PHT+PB中剂量混合组与PHT+PB高剂量混合组海马神经元细胞平均凋亡率有差别（P0.05)。小脑神经元：不同处理组对小脑神经元细胞平均凋亡率有影响；进行组间分析得出：NS组与PHT组小脑神经元细胞平均凋亡率有差别（P0.05),PHT组与PHT+PB低剂量混合组小脑神经元细胞平均凋亡率无差别（P0.05)，PHT组与PHT+PB中剂量混合组小脑神经元细胞平均凋亡率有差别（P0.05)，PHT组与PHT+PB高剂量混合组小脑神经元细胞平均凋亡率有差别（P0.05)，PHT+PB中剂量混合组与PHT+PB高剂量混合组小脑神经元细胞平均凋亡率有差别（P0.05)。结论： 1治疗剂量PHT导致正常昆明小鼠海马、小脑神经细胞中凋亡相关蛋白Bax表达增多，Bcl-2表达减少；TUNEL法检测可见细胞排列紊乱，大量形状不规则，胞核固缩的凋亡细胞出现。 2PHT+PB低、中、高剂量混合组中海马、小脑神经细胞凋亡相关蛋Bax、Bcl-2表达存在差异：PHT+PB低剂量混合组Bax表达增多，Bcl-2表达减少；PHT+PB高剂量混合组Bax表达减少，Bcl-2表达增多；PHT+PB中剂量混合组Bax、Bcl-2的表达介于二者之间。 3PHT+PB低剂量混合组与PHT组相比海马、小脑神经细胞凋亡相关蛋Bax、Bcl-2表达无差别（P0.05)；PHT+PB中、高剂量混合组与PHT组相比Bax、Bcl-2表达有差别（P0.05),说明普罗布考可能通过抑制Bax的表达，促进Bcl-2的表达，抑制神经细胞过度凋亡，从而发挥其神经保护作用；且中、高剂量混合组相比有统计学意义，说明这种保护作用可能存在剂量相关性。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R742.1

【参考文献】