木丹颗粒治疗痛性糖尿病周围神经病变的实验研究

发布时间：2018-04-11 06:38

  本文选题：痛性糖尿病周围神经病变 + 木丹颗粒　； 参考：《辽宁中医药大学》2015年博士论文

【摘要】：目的:糖尿病(DM)是临床上比较多见的一种慢性代谢性疾病,而糖尿病周围神经病变(DPN)是DM常见的一种慢性神经并发症,患病率高达47%~91%,其中痛性糖尿病周围神经病变(PDPN)的发生率可以达到13%~26%,是DPN早期的临床体征之一,给DM患者带来了很大的困苦,甚至导致糖尿病患者截肢、致死的严重后果。PDPN常见的临床表现有肢体对称性麻木、疼痛、烧灼感、发凉、感觉减退,下午或夜间加重,以触痛(allodynia)、自发痛(spontaneous pain)、痛觉过敏(hyperalgesia)为神经病理性疼痛特征。然而,目前其发病机制比较复杂,尚不完全清楚,可能与氧化应激、离子通道、炎症反应、高血糖等多种因素有关。糖尿病预防和治疗的规范化纲要中,明确指出延缓糖尿病并发症的发生和发展是糖尿病三级预防。现代医学上治疗多采用控制血糖、抗抑郁类药物、改善微循环、抗氧化、营养神经、离子通道抑制剂、抗癫痫药或阿片类药物等。但是,即使采用以上多种治疗方法,疼痛仍然不能减轻。目前也没有满意治疗效果的方案,而且西药副作用大,不良反应多,而中医药强调辨证施治,标本同治,整体调节,从多个角度,多个靶点治疗,且无确切的副作用,在DPN治疗方面发挥了明显优势。木丹颗粒是于世家教授结合多年的临床实践,根据中医基础理论和中药学,辨病、辨证制定的方药,精选黄芪,延胡索,三七,赤芍,丹参,川芎,红花,苏木,鸡血藤九味中药,严密配伍而成。该药以益气活血,通络止痛而立法,临床上治疗本病的疗效确切。以前研究结果证实,木丹颗粒明显提高糖尿病大鼠的坐骨神经Na+-K+-ATP酶活性,上调糖尿病大鼠坐骨神经NGF、IGF-l蛋白的表达,改善患者血浆内啡肽水平,从结构及功能上对周围神经起到保护作用,具有中医独特的优势,为进一步探索其对PDPN的作用机制奠定了一定基础。本次研究首先建立痛性糖尿病周围神经病变(PDPN)的动物模型,运用病理形态学、RT-PCR法,酶联免疫法、免疫组化法等现代医学检测方法,从组织形态和分子水平角度探讨木丹颗粒对PDPN的作用机制。材料与方法:雄性Wistar大鼠180只,体质量180~220g,8周(w)龄,适应性喂养1周后,按体重层次随机取30只,分为三组,分别为2w、4w、8w正常组(每组10只),其余造模,应用链脲佐菌素(STZ)诱发PDPN大鼠模型,成模后的大鼠按血糖层次随机分为,2w、4w、8w模型组(各12只)、2w、4w、8w苯妥英钠组(各12只)、2w、4w、8w木丹颗粒组(各12只),以上各组均从成模后开始每日灌胃给药一次,连续8周,至各组实验结束。在给药治疗后的第2、4、8周末,各组三个时间段随机取8只大鼠,处死前测定大鼠尾静脉血糖,机械性痛阈,坐骨神经传导速度,以观察大鼠血糖、行为学及神经电生理的动态变化;麻醉后取大鼠腓肠神经制作病理切片和电镜切片,应用光镜及电镜观察其超微结构变化,取L4-5背根神经节应用光镜观察其形态学变化;另取大鼠L4-5背根神经节及脊髓,采用免疫组化法及RT-PCR法观察N型Ca2+通道及Kv7.3通道基因表达的变化;应用酶联免疫法测定大鼠L4-5脊髓的TNF-α和IL-6水平的变化。结果:第一部分木丹颗粒对PDPN大鼠神经电生理和病理形态学的影响(1)木丹颗粒能够明显地改善糖尿病大鼠的症状。与模型组相比较,木丹颗粒组大鼠精神状态比较好,饮水量、进食量和尿量都明显减少。实验期间,正常组大鼠的体质量明显增加,而模型组大鼠的体质量明显下降,与正常组比较,2w、4w和8w时,有显著性差异(P0.01);而木丹颗粒组大鼠的体质量变化不明显,与模型组相比,无统计学差异,与正常组比较,在2w和4w时有统计学意义(P0.05),8w时,有显著性差异(P0.01)。(2)实验期间,随着时间延长,模型组大鼠血糖明显升高,与正常组相比,2w,4w和8w时都有显著性差异(P0.01);而治疗组血糖变化不明显,与模型组比,无统计学差异(P0.05),与正常组相比,血糖仍高于正常组,在2w,4w,8w时有显著性差异(P0.01)。(3)模型组大鼠机械性痛阈值随着实验时间延长,呈现明显下降趋势,与正常组相比,2w,4w和8w时有显著性差异(P0.01);而治疗组大鼠机械性痛阈值与模型组相比,呈升高趋势,在2w时有统计学意义(P0.05),4w和8w时,有显著性差异(P0.01),与正常组相比,在2w和4w时有统计学意义(P0.05),8w时无统计学差异(P0.05)。(4)实验期间,随着时间延长,模型组大鼠坐骨神经传导速度(NCV)明显降低,与正常组相比,在2w,4w,8w时有显著性差异(P0.01)。木丹颗粒组大鼠NCV与同期模型组比较,有所加快,2w和4w时有统计学意义(P0.05),8周时有显著性差异(P0.01),与正常组相比,2w、4w和8w时有统计学意义(P0.05);苯妥英钠组与正常组相比,2w、4w和8w时有显著性差异(P0.01),与模型组比较,无统计学差异(P0.05)。(5)从组织超微结构观察到,正常组大鼠腓肠神经纤维的髓鞘板层结构清晰,致密、均匀、形态规则,轴索无肿胀及萎缩,神经膜结构正常。而模型组大鼠腓肠神经纤维髓鞘结构模糊、松散,轴索微丝及微管断裂,溶解,髓鞘脱失和板层分离现象,雪旺细胞的细胞核出现不规则,线粒体空泡形成。模型组大鼠随着时间延长,神经损害更加严重,而治疗组明显减轻其损害,效果优于模型组。第二部分木丹颗粒对PDPN大鼠的N型钙离子通道和钾离子通道Kv7.3表达的影响(1)木丹颗粒对PDPN大鼠的N型钙离子通道表达的影响RT-PCR法测定结果:模型组大鼠L4-5背根神经节N型钙离子通道m RNA表达水平随着时间延长,呈现逐渐上升趋势,与正常组相比,有统计学差异(P0.05);治疗组大鼠m RNA表达水平随着时间延长,呈现逐渐下降的趋势,与模型组比,在4w和8w时有统计学差异(P0.05),与正常组比较,2w时有统计学差异(P0.05);而木丹颗粒组和苯妥英钠组两组m RNA表达水平无统计学差异(P0.05)。免疫组化法测定结果:正常组少见阳性细胞表达,模型组在各时间点(2w、4w、8w)阳性表达开始逐渐增强,在脊髓内有大量胞质呈棕色的N型Ca2+通道表达的阳性细胞分布,与正常组相比有统计学差异(P0.05)。木丹颗粒组和苯妥英钠组与模型组比较,阳性细胞表达呈现减弱的趋势,在2周时无统计学意义(P0.05),在4周时有统计学意义(P0.05),在8周时有显著性差异(P0.01);与正常组比较,阳性细胞表达强,2周时有统计学意义(P0.05),而4周和8周时无统计学意义(P0.05)。并且在2w、4w、8w时,L4-5背根神经节中阳性表达比脊髓中的强。(2)木丹颗粒对PDPN大鼠的钾离子通道Kv7.3表达的影响RT-PCR法测定结果:模型组L4-5背根神经节钾离子通道Kv7.3 m RNA表达减少,与正常组相比,在2周时有统计学差异(P0.05),在4周和8周时有显著性差异(P0.01)。而木丹颗粒组和苯妥英钠组m RNA表达逐渐增加,与模型组比,2w时,木丹颗粒组和苯妥英钠组m RNA表达虽有增加,但无统计学意义(P0.05),在4周时有统计学意义(P0.05),8w时有显著性差异(P0.01),而与正常组比较,在2周时有统计学意义(P0.05),而在4周和8周时无统计学意义(P0.05)。免疫组化法测定结果:正常组大鼠L4-5背根神经节细胞区有大量胞质呈棕色的Kv7.3通道表达的阳性细胞分布,阳性细胞表达较强;模型组在各时间点(2周、4周、8周)阳性表达开始逐渐减弱,表达明显低于正常组,与正常组比较,在2周时有统计学意义(P0.05),在4周和8周时有显著性差异(P0.01)。木丹颗粒组和苯妥英钠组阳性细胞表达呈现增强的趋势,与模型组比较,在4周时有统计学意义(P0.05),在8周时阳性细胞表达明显增加,有显著性差异(P0.01),而与正常组比较,阳性细胞表达稍弱,在2周时有统计学意义(P0.05),而在4周和8周时无统计学意义(P0.05);而且在2w,4w和8w背根神经节中的表达比脊髓中强。第三部分木丹颗粒对PDPN大鼠TNF-α和IL-6水平的影响模型组大鼠脊髓TNF-α和IL-6水平较正常组明显升高,与时间呈正相关(2w时P0.05;而4w和8w时P0.01),木丹颗粒可以明显下调TNF-α和IL-6水平,与模型组相比,2w和4w时P0.05;8w时P0.01)。结论:第一部分木丹颗粒对PDPN大鼠的神经电生理和病理形态学的影响(1)链脲佐菌素53mg/Kg单次腹腔注射所诱导PDPN大鼠模型的方法有一定的可行性的。(2)木丹颗粒只有抑制PDPN大鼠血糖升高作用。(3)木丹颗粒能够提高PDPN大鼠的机械性痛阈值。(4)木丹颗粒可以促进PDPN大鼠的坐骨神经传导速度加快。(5)木丹颗粒对PDPN大鼠腓肠神经及背根神经节组织的损伤具有保护作用第二部分木丹颗粒对PDPN大鼠的N型钙离子通道和钾通道Kv7.3表达的影响木丹颗粒可能通过下调PDPN大鼠L4-5背根神经节及脊髓N型钙离子通道基因表达,上调钾离子通道Kv7.3基因表达的作用,起到减轻了PDPN所引起神经性疼痛等症状。第三部分木丹颗粒对PDPN大鼠TNF-α和IL-6水平的影响木丹颗粒可能通过下调TNF-α和IL-6水平,从而对PDPN大鼠起到抑制炎症作用。
[Abstract]:Objective : Diabetes mellitus ( DM ) is a kind of chronic metabolic disease in clinic . The incidence of diabetic peripheral neuropathy ( PDPN ) can reach 13 % 锝，

本文编号：1734841