血管紧张素Ⅱ2型受体过表达对肝癌细胞体内外生长的影响

发布时间：2018-04-11 11:19

本文选题：原发性肝癌 + A12R　；参考：《南方医科大学》2014年硕士论文

【摘要】：研究背景原发性肝癌(HCC)是我国常见恶性肿瘤之一,死亡率在消化系统恶性肿瘤中位列第3。我国每年死于肝癌约11万人,占全世界肝癌死亡人数的45%。一旦被诊断为晚期肝癌,无论是对患者本身还是家庭都是具有灾难性的,而对于这些晚期的肝癌患者,常规疗法已不再起作用。此外,肿瘤细胞中高效的药物代谢和具耐药性的运输蛋白的存在,也进一步降低了治疗肝癌的疗效。因此,我们需要更改治疗方案来克服这些障碍,从而提高治疗效果。血管紧张素II(Ang II),通过两个明确的受体：AngII1型(AT1R)和2型受体(AT2R),在肾素-血管紧张素系统(RAS)中发挥关键作用。最近的研究表明Ang II信号在肿瘤发生过程中起着重要的作用。使用小鼠肝癌的模型,Yoshiji和同事发现基于一种血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂(培哚普利[PE])的联合治疗能够抑制由血管内皮生长因子(VEGF)过表达引起的血管生成.AT2R在多种细胞系中发挥着抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用,如血管平滑肌细胞、心肌细胞、神经细胞、成纤维细胞,内皮细胞,前列腺癌和肺癌细胞,但AT2R对HCC的作用目前还不清楚。本研究的目的是探索AT2R过表达对肝癌细胞和人原发性肝癌的裸鼠模型的影响。将AT2R重组腺病毒载体(Ad-G-AT2R-EGFP)感染肝癌细胞株及原位肿瘤,以检测其对肝癌细胞的抑制作用。结果表明高剂量Ad-G-AT2R-EGFP诱导的AT2R过表达促使肝癌细胞凋亡。AT2R在SMMC7721细胞的过表达能抑制细胞增殖,使S期细胞显著减少,并通过改变CD4和cyclinD1的表达使G1期细胞增多。数据还表明,过表达的AT2R是通过细胞死亡信号通路导致细胞凋亡的,这条通路依赖激活人的p38MAPK,JNK,caspase-3同时使pp42/44MAPK(Erkl/2)失活来产生作用。最后,我们证明了适度增加AT2R表达可能会增加HCC肿瘤的生长和肝癌细胞在体内的增殖。我们的研究结果表明AT2R过表达控制着肝癌细胞在体外和体内的增殖,而AT2R对肝癌细胞生长的影响可能与的表达水平有关,但是这一现象的明确机制尚待进一步研究。本课题以人肝癌细胞为主要研究对象,从以下几个方面展开研究：一.AT2R过表达对肝癌细胞的影响目的：明确肝癌细胞中内源性AT2R的表达情况以及AT2R过表达对肝癌细胞的影响。方法：Real-time PCR从基因水平检测肝癌细胞AT2R的表达情况。流式细胞仪检测细胞周期,WST-1细胞增殖试验,TUNEL染色检测细胞凋亡,检测腺病毒介导的AT2R过表达对肝癌细胞生长增殖以及凋亡的影响。结论：1.检测细胞内源性AT2R的表达情况使用Real-time PCR检测肝癌细胞SMMC7721、Be17402、HepG2中内源性AT2R的表达情况,Real-time PCR结果Ct值大于33.0,结果提示肝癌细胞中内源性AT2R表达量较低,基本检测不到。 2.AT2R重组腺病毒载体转导细胞效果的验证 (1)AT2R重组腺病毒载体转导细胞的效果本研究中使用的AT2R重组腺病毒载体Ad-G-AT2R-EGFP及对照载体Ad-EGFP,两个载体均为在CMV启动子控制下的5型腺病毒,已被证明能在多种细胞或组织中介导外源基因高效表达,对肝癌细胞SMMC7721和Bel7402以及正常肝细胞系L02的感染效率均可达到95%以上。病毒载体感染肝癌细胞SMMC7721和Bel7402以及正常肝细胞LO236hrs后,荧光显微镜观察,SMMC7721和Bel7402细胞出现皱缩,开始出现类似凋亡的现象(Fig.l)。 (2)不同剂量病毒感染肝癌细胞AT2RmRNA的表达情况使用1-500ifu/cell剂量的AT2R重组腺病毒感染肝癌细胞SMMC7721,24hrs后real-time PCR检测AT2R mRNA表达情况。SMMC7721内源性AT2RmRNA基本检测不到,以感染1ifu/cell剂量的SMMC7721细胞中AT2RmRNA表达量作为参照,转染不同剂量AT2R重组腺病毒(1-500ifu/cell)的肝癌细胞SMMC7721中AT2RmRNA相对表达情况呈倍数增长(Fig.2),证明AT2R的表达量随着加入的腺病毒量增加而增加。 3.腺病毒介导的AT2R过表达对肝癌细胞周期和生长的影响 AT2R重组腺病毒载体及对照载体感染肝癌细胞SMMC7721和正常肝细胞LO224hrs后,70%乙醇固定细胞,RNase A处理细胞,PI染色,流式细胞仪检测细胞周期,结果表明AT2R过表达可明显抑制肝癌细胞SMMC7721的生长增殖,使细胞停留在G1期(Fig.3A),而对正常肝细胞L02无明显影响(Fig.3B,C)。分别用AT2R及对照的腺病毒载体感染肝癌细胞SMMC7721,加入WST-1作用2hrs后,酶标仪检测OD450。连续测定6天,绘制曲线,发现AT2R过表达可抑制肝癌细胞的增殖(p0.01)(Fig.4A),同时Western-Blot检测结果表明与细胞周期相关的蛋白CDK4和cyclin D1表达下调(Fig.4B),结果初步提示AT2R过表达可通过CDK4和cyclin D1表达变化阻滞细胞停留在G1期,从而抑制肝癌细胞的生长和增殖。 4.腺病毒介导的AT2R过表达对肝癌细胞凋亡诱导的影响 AT2R重组腺病毒载体及对照载体感染肝癌细胞SMMC7721和Bel740248hrs后,多聚甲醛固定细胞,进行TUNEL染色,观察凋亡效果(Fig.5)。结果提示AT2R重组腺病毒介导的AT2R过表达可诱导肝癌细胞SMMC7721和Be17402发生凋亡。结果表明,从基因水平检测得出肝癌细胞SMMC7721中AT2R的表达很低,几乎可以忽略；另外我们通过AT2R过表达对肝癌细胞生长、增殖以及细胞凋亡的影响研究发现由腺病毒介导的AT2R过表达可明显抑制肝癌细胞的生长增殖,使细胞停留在G1期,并且导致肝癌细胞发生明显的凋亡现象,而对正常肝细胞未有显著影响。二.AT2R过表达对肝癌细胞凋亡诱导作用的分子机制目的：确定肝癌细胞中与过表达的AT2R最直接的相互作用蛋白,确定AT2R对肝癌细胞的促凋亡作用的信号通路和调节机制,寻找相互作用蛋白与凋亡相关信号通路之间的关键分子,建立其与诱导凋亡的信号通路之间的联系。方法：分别用AT2R及对照的腺病毒载体感染肝癌细胞SMMC7721,检测细胞生长增殖情况,绘制细胞生长曲线,TUNEL染色观察细胞凋亡情况,Western-Blot检测MAPK家族相关激酶(p38MAPK,Erk或JNK)通路上游关键分子的表达情况。在AT2R及其对照的腺病毒载体感染肝癌细胞SMMC7721前后,Western Blot分析相关激酶的磷酸化水平和蛋白质水平,细胞内Caspase-3,Caspase-8活性检测。结论：1.相关激酶活性检测 AT2R重组腺病毒载体及对照载体感染肝癌细胞SMMC7721,经36hrs后收集细胞,Western-Blot检测p38、p42/p44MAPK(Erkl/2)、JNK及其相应磷酸化的pp38、pp42/p44MAPK(pErk1/2)、pJNK/JNK的表达情况(Fig.9)。与对照相比,AT2R过表达的肝癌细胞SMMC7721中pp38/p38的比例有所提高,pp42/p44MAPK(pErk1/2)下调,pJNK/JNK与对照组相比表达增高,初步提示AT2R过表达对细胞产生的影响可能是通过激活p38和JNK同时抑制p42/p44MAPK(Erk1/2)的激活来实现的。 2.确定AT2R对肝癌细胞的促凋亡作用的信号通路和调节机制不同浓度AT2R重组腺病毒载体及对照载体感染肝癌细胞SMMC7721,36hrs后收集细胞,使用Caspase-3和cleaved Caspase-3抗体western blot检测细胞中Caspase-3和Caspase-8的激活情况,同时使用Caspase-3活性检测试剂盒检测其活性,结果发现细胞的凋亡过程中有caspase-3和Caspase-8的激活。三.腺病毒介导的AT2R过表达对肝癌原位移植瘤裸鼠模型的影响目的：建立可活体观察的肝癌原位移植瘤裸鼠模型。构建AT2R及对照的腺病毒表达载体,全面评估由腺病毒介导的AT2R过表达对肿瘤生长的影响。方法：建立稳定表达红色荧光素酶的肝癌细胞株,取4-5周龄裸鼠,手术开腹暴露肝脏,将稳定表达红色荧光素酶的肝癌细胞SMMC7721细胞悬液肝脏原位注射,制作肝癌裸鼠移植瘤模型。将裸鼠随机分组.三天后尾静脉注射0.1m1腺病毒载体Ad-G-AT2R-EGFP、Ad-G-EGFP或PBS,病毒量为1×109感染单位/(只·次)],1次/2天,共3次。经裸鼠腹腔注射荧光素酶底物D-Luciferin Ksalt,麻醉固定裸鼠,Xenogen IVIS-200小动物荧光活体成像仪动态监控裸鼠中肿瘤生长情况。注射病毒一个月后,利用荧光活体成像仪图像动态监控裸鼠中肿瘤生长情况进行分析定量评估。腺病毒靶器官感染效果的评价,Real-time PCR检测靶器官AT2R基因的表达水平。观察裸鼠存活期,病理学观察、及癌细胞增殖抗原(Ki67)检测。结论：1.建立稳定表达红色荧光素酶的肝癌细胞构建含荧光素酶的慢病毒载体pTYF-CMV-LUC-2A-RFP系统,并转导肝癌细胞SMMC7721,加入底物D-Luciferin K salt反应后,Xenogen IVIS-200小动物荧光活体成像仪观察荧光,结果显示稳定表达荧光素酶的肝癌细胞株成功建立(Fig.7)。 2.建立稳定表达红色荧光素酶的肝癌移植瘤裸鼠模型表达荧光素酶的肝癌细胞SMMC7721原位注射BALB/c裸鼠肝脏,建立裸鼠肝癌模型,Xenogen IVIS-200小动物荧光活体成像仪观察裸鼠中肝癌的生长情况(Fig.8A)。 3.腺病毒介导的AT2R过表达对肝癌原位注射瘤生长的影响。肝癌细胞原位注射三周后,裸鼠尾静脉注射AT2R腺病毒载体及其对照病毒载体,一个月后荧光活体成像仪观察裸鼠中肝癌生长情况,处死裸鼠取肝脏肿瘤组织,计算体积并称重。Real-time PCR检测不同实验组和对照组肝脏肿瘤组织中AT2R mRNA表达情况,结果发现AT2R重组腺病毒实验组肝组织肿瘤体积与病毒对照组及PBS对照组有明显差异,检测实验组相应肝脏肿瘤组织中AT2R mRNA表达量仅不足10ifu/cell(Fig.8D)。AT2R mRNA的表达在Ad-CMV-EGFP或PBS组中几乎检测不到。随后进行免疫组织化学分析Ki67在肿瘤组织表达。如Fig.8所示,用Ad-G-AT2R-EGFP治疗的小鼠SMMC7721细胞增殖显著增强,这与用高剂量Ad-G-AT2R-EGFP转导处理的SMMC7721细胞培养模型所观察到的结果相反(P0.05)。综上所述,高水平表达的AT2R可能诱导细胞凋亡和抑制肿瘤细胞增殖,适度增加体内AT2R表达实际上可能促进肝癌SMMC7721细胞增殖和肿瘤生长。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R735.7

【参考文献】