激活TRPV4受体对成年海马齿回神经再生的作用及其分子机制

发布时间：2018-04-12 13:30

本文选题：瞬时感受器电位香草素受体亚家族Ⅳ型 + 神经再生　；参考：《南京医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：研究背景成年哺乳动物脑内的神经再生(adult neurogenesis)对于维持脑的正常功能具有重要意义。神经再生过程主要包括干细胞的增殖、前体细胞的存活和分化、新生神经元的成熟、突触形成和神经回路整合等几个阶段。钙离子(calcium,Ca2+)作为细胞内重要的第二信使,在细胞的增殖、发育、迁移和存活等多个过程中起重要调节作用。瞬时感受器电位香草素受体亚家族Ⅳ型(transient receptor potential vanilloid 4,TRPV4)是瞬时感受器电位(transient receptor potential,TRP)受体家族成员之一。TRPV4受体广泛分布在中枢神经系统的海马、大脑皮层、丘脑和小脑等脑区。TRPV4受体是一种对Ca2+具有选择通透性的阳离子通道,激活TRPV4受体可引起胞内游离钙离子水平(intracellular free Ca2+concentration,[Ca2+]i)升高。TRPV4受体激活后可通过其介导的Ca2+内流促进猪内皮细胞、食管内皮细胞和人脑毛细血管内皮细胞的增殖。此外,[Ca2+]i水平对神经元的突起生长起重要调节作用,[Ca2+]i过高或过低都能显著抑制神经元的轴突延伸和树突发育。TRPV4受体功能获得性基因突变所致的[Ca2+]i升高在周围运动神经元轴突病变过程中起着重要的作用。然而,目前尚无有关TRPV4受体调控成年海马神经再生的相关报道。丝裂素活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)信号通路在细胞的增殖、分化、迁移和存活等过程中起重要调控作用。在肺内皮细胞、三叉神经节、背根神经节感觉神经元、毛细血管内皮细胞、脂肪细胞以及海马神经元上的研究发现,TRPV4受体激活后能够上调细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)和 p38 MAPK 信号通路。AMP 激活的蛋白激酶(Adenosine 5'-monophosphate(AMP)-activated protein kinase,AMPK)是一类重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,AMPK激活后通过作用于下游一系列与突起生长有关的信号通路,导致细胞骨架降解,抑制神经突起生长。蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)通过调节其下游的信号分子如哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)和糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase3β,GSK3β)的活性在神经元突起生长过程中发挥重要作用。本课题组前期研究发现,急性激活TRPV4受体可通过其介导的钙离子内流影响AMPK-Akt信号通路的活性。基于上述报道和前期研究,本课题提出激活TRPV4受体可能通过MAPK或AMPK-Akt信号通路调节成年海马齿回神经干细胞增殖和新生神经元突起生长,为调控成年海马神经再生提供新靶点。研究目的1.明确激活TRPV4受体对海马齿回神经干细胞增殖的作用及其机制。2.明确激活TRPV4受体对海马齿回新生神经元突起生长的作用及其机制。第一部分激活TRPV4受体对成年海马齿回神经干细胞增殖的作用及其分子机制材料与方法1.制备TRPV4受体激活的在体模型:侧脑室注射不同剂量的TRPV4受体激动剂GSK1016790A,制备TRPV4受体激活的在体模型。2.免疫组织化学染色:5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU)用PBS溶解后按照每只小鼠50 mg/kg的剂量连续腹腔注射3次,间隔8 h,标记有丝分裂的细胞。小鼠用水合氯醛腹腔麻醉(400 mg/kg)后,先后用PBS和4%多聚甲醛进行心脏灌流固定,取脑组织后于4%多聚甲醛固定液(4℃)中固定48 h。选择海马部位,用振动切片机进行冠状连续切片,进行BrdU和Ki67免疫组织化学染色,检测激活TRPV4受体对神经干细胞增殖的作用。3.蛋白印迹(Western blot):检测GSK1016790A对海马组织目标蛋白的作用。结果1.给予GSK1016790A能增加海马齿回SGZ区1天龄BrdU阳性细胞(1-day-old BrdU positive,1-day-old BrdU+)和 Ki67 阳性细胞(Ki67 positive,Ki67+)数目,增加增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的蛋白水平。2.给予GSK1016790A能显著增加海马组织周期素依赖性激酶2(cyclin dependent kinase 2,CDK2)和 CDK6,周期素 El(cyclinEl)和 cyclinA2,以及磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白(phosphorylated retinoblastoma protein,p-Rb)的蛋白水平,但对CDK4和cyclinDl蛋白水平无显著影响。3.给予GSK1016790A能显著增加海马组织磷酸化ERK1/2(phosphorylated ERK1/2,p-ERKl/2)和磷酸化 p38 MAPK(phosphorylated p38 MAPK,p-p38 MAPK)蛋白水平。4.丝裂素活化蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase,MEK)的抑制剂U0126或p38 MAPK特异性抑制剂SB203580能显著降低GSK1016790A注射组小鼠1-day-old BrdU+和Ki67+细胞数目及PCNA蛋白水平。给予U0126或SB203580能明显降低GSK1016790A注射组小鼠CDK2和 CDK6,cyclin E1 和 cyclin A2,以及 p-Rb 蛋白水平。结论激活TRPV4受体可通过增强ERK和p38 MAPK信号通路增加细胞周期相关蛋白CDK2、CDK6和cyclinEl、cyclinA2表达,提高Rb的磷酸化水平,加速细胞周期进程,促进成年海马齿回神经干细胞增殖。第二部分激活TRPV4受体对成年小鼠海马齿回新生神经元突起生长的作用及分子机制材料与方法1.制备TRPV4受体激活的在体模型:侧脑室注射不同浓度剂量的TRPV4受体激动剂GSK1016790A,制备激活TRPV4受体的在体模型。2.免疫组织化学染色:小鼠用水合氯醛腹腔麻醉(400mg/kg)后,先后用PBS和4%多聚甲醛进行心脏灌流固定,取脑组织后于4%多聚甲醛固定液(4℃)中后固定48 h。选择海马部位,用振动切片机进行冠状连续切片,进行双皮质素(doublecortin,DCX)免疫组织化学染色,检测激活TRPV4受体对新生神经元突起生长的作用。3.蛋白印迹(Western blot):检测GSK1016790A对海马组织目标蛋白表达的作用。结果1.侧脑室注射GSK1016790A能显著降低成年小鼠海马齿回DCX阳性细胞(doublecortin positive,DCX+)及突起数目。2.给予 GSK1016790A 30 min 至 2 h 磷酸化 AMPK(phosphorylated AMPK,p-AMPK)的蛋白水平显著增加;给予GSK1016790A 1 d至5 d p-AMPK蛋白水平显著降低;给予GSK1016790A 30min至5d磷酸化Akt(phosphorylated Akt,p-Akt)的蛋白水平显著降低。给予AMPK抑制剂compound C能明显阻断GSK1016790A降低p-Akt蛋白水平的作用,而给予AMPK激动剂AICAR则无此作用。3.给予 GSK1016790A 能够明显降低磷酸化 mTOR(phosphorylaed mTOR,p-mTOR)和磷酸化 70kDa 核糖体蛋白 S6 激酶(phosphorylaed p70 ribosomal S6 kinase,p-p70S6K)的蛋白水平;给予磷酸肌醇3激酶的激动剂740 Y-P或compound C能有效阻断GSK1016790A的上述作用。给予GSK1016790A能够显著增加磷酸化 GSK3β(Y216)位点(phosphorylatedGSK3βatY216,p-GSK3βY216)的蛋白水平、磷酸化微管相关蛋白2(phosphorylated microtubule-associated protein 2,p-MAP2)和磷酸化坍塌反应调节蛋白 2(phosphorylation of collapsin response mediator protein-2,p-CRMP-2)的水平;给予740 Y-P或compound C能有效阻断GSK1016790A增加p-GSK3βY216、p-MAP2 和 p-CRMP-2 蛋白水平的作用。4.给予compound C或740 Y-P能显著增加GSK1016790A注射组小鼠海马齿回DCX+细胞及神经突起的数目,而给予AICAR对GSK1016790A减少DCX+细胞及神经突起数目的作用无影响。结论激活TRPV4受体通过增强AMPK的活性下调Akt信号通路,进而抑制mTOR-p70S6K信号通路、激活GSK3β抑制MAP2和CRMP-2的功能,最终抑制新生神经元的突起生长。
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【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q42

【参考文献】