CB1受体介导STAT3磷酸化上调SOD2参与电针预处理脑保护的研究

发布时间：2018-04-18 07:12

本文选题：缺血/再灌注 + 预处理　；参考：《第四军医大学》2014年硕士论文

【摘要】：近年来缺血性脑卒中发病率、致死率以及致残率均居高不下，已成为导致人类死亡的“第二大杀手”。氧化应激是导致缺血再灌注损伤的主要病理生理机制之一，抑制氧化应激能够有效减轻缺血再灌注损伤。作为体内抗氧化系统的重要组成，内源性/外源性激活SOD2能够有效减轻氧化应激。SOD2也是诸多非缺血预处理措施诱导脑保护效应的靶点之一。作为非缺血预处理的重要组成，电针预处理因其安全性高、可操作性强等优点被认为是潜在的可靠防护缺血性脑卒中有效措施，而且其作用机制也被证实同样与抗氧化系统相关。但电针预处理是否也通过激活SOD2信号发挥脑保护效应并不明确，而且电针预处理调控SOD2激活的上游信号机制也尚未清楚。基于前期研究，为解决上述问题，本课题将重点回答：1.电针预处理是否通过上调SOD2表达诱导脑缺血耐受；2.氧化应激损伤是造成缺血再灌注损伤的重要机制，电针预处理激活SOD2是否通过减轻氧化应激损伤发挥脑保护效应？3. STAT3已被报道证实为SOD2的上游调控分子，我们前期研究证实电针预处理通过CB1受体调节STAT3磷酸化，那么电针预处理对STAT3/SOD2的调控是否也由CB1受体介导？实验一电针预处理对小鼠脑缺血再灌注后SOD2表达的影响目的明确电针预处理对小鼠脑缺血再灌注后SOD2表达的影响方法将24只雄性C57BL/6小鼠分为4组：假手术组（sham组）、单纯电针组（EA组）、模型组（MCAO组）、电针预处理组（EA+MCAO组）。Sham组：腹腔注射10%水合氯醛（350mg/kg）麻醉后，行假手术；EA组：腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，取“百会穴”，疏密波、2/15Hz、1mA，持续电刺激30min，电针2h后取材；MCAO组：麻醉后进行MCAO模型，大脑中动脉缺血1h后再灌；EA+MCAO组：麻醉后取“百会穴”，持续电针30min，电针后2h进行MCAO模型，大脑中动脉缺血1h后进行再灌。所有小鼠将于缺血再灌注2h后取材，进行western-blot、免疫荧光检测SOD2表达变化情况。结果 1.电针预处理上调小鼠脑缺血再灌注后SOD2蛋白表达Western-blot显示缺血再灌注2h后，与sham组相比，EA组SOD2表达无明显变化，而MCAO组SOD2表达明显下降（P0.05）；与MCAO组相比， EA+MCAO组SOD2表达明显升高（P0.05）。 2.电针预处理增强神经元SOD2免疫荧光强度免疫荧光结果显示，缺血再灌注2h后，与sham组相比，EA组SOD2免疫荧光本实验首先验证电针预处理是否影响脑缺血再灌注损伤后SOD2的表达。其次，研究电针预处理对SOD2激活的上游调控机制：探寻电针预处理是否通过CB1受体介导STAT3上调SOD2表达，激活抗氧化系统，减轻氧化应激损伤，最终发挥脑保护作用。从而为电针等非缺血性预处理脑保护措施分子机制揭示做出贡献，也为其临床应用推广提供更多基础实验证据，奠定坚实理论基础。强度无明显改变，而MCAO组SOD2免疫荧光减弱；与MCAO组相比，电针预处理则增加了SOD2免疫荧光强度，SOD2与神经元标记物NeuN重叠增加。结论电针预处理可以上调小鼠脑缺血再灌注后神经元SOD2的表达。实验二电针预处理上调SOD2减轻氧化应激损伤诱导脑缺血耐受目的 1.验证SOD2-siRNA下调SOD2表达是否逆转电针预处理的抗氧化作用 2.验证SOD2-siRNA是否逆转电针预处理的脑保护效应方法 1.验证SOD2-siRNA干扰效能将24只雄性C57BL/6小鼠分为4组：对照组（sham组）、溶剂组（vehicle组）、SOD2-siRNA组、control siRNA组。Sham组：腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，仅行假手术；SOD2-siRNA组、control siRNA组、vehicle组：腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，分别给予侧脑室注射SOD2-siRNA、control siRNA和溶剂。侧脑室注射72h后，取缺血半暗带相应位置进行western-blot。 2. SOD2-siRNA逆转电针预处理的抗氧化效应将48只雄性C57BL/6小鼠分为6组：假手术组（sham组）、单纯电针组（EA组）、模型组（MCAO组）、电针预处理组（EA+MCAO组）、SOD2-siRNA组（EA+SOD2-siRNA组）、control siRNA组（EA+control siRNA组），其中sham组、MCAO组、EA组、EA+MCAO组处理方法如前所述；EA+SOD2-siRNA组、control siRNA组：腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，分别进行侧脑室注射SOD2-siRNA、control siRNA，72h后进行MCAO模型，大脑中动脉缺血1h后再灌。缺血再灌注24h后，取缺血半暗带进行Elisa检测，测定ROS、MDA、8-OHdG、nitrotyrosine含量，以及DHE染色观察超氧阴离子表达情况。 3. SOD2-siRNA逆转电针预处理的脑保护效应将36只雄性C57BL/6小鼠分为6组：假手术组（sham组）、单纯电针组（EA组）、模型组（MCAO组）、电针预处理组（EA+MCAO组）、SOD2-siRNA组（EA+SOD2-siRNA组）、control siRNA组（EA+control siRNA组），，其处理方法如前所述。缺血再灌注24h后取材，进行TTC染色、脑梗死容积百分比、神经行为学评分（Longa评分）、TUNEL染色。结果 1. SOD2-siRNA明显下调小鼠脑内SOD2表达 Western-blot结果显示与sham组相比，vehicle组和control siRNA组SOD2表达无明显变化，而SOD2-siRNA组SOD2表达明显下降（P0.05）。 2. SOD2-siRNA逆转电针预处理的抗氧化效应 Elisa检测结果显示：与sham组相比，MCAO组ROS、MDA、8-OHdG、nitrotyrosine含量均明显升高（P0.05）；与MCAO组相比， EA+MCAO组ROS、MDA、8-OH-dG、nitrotyrosine含量均明显降低（P0.05）；而与EA+MCAO组相比，EA+SOD2-siRNA组ROS、MDA、8-OHdG、nitrotyrosine含量均明显升高（P0.05）。 DHE染色结果与Elisa结果相一致，与sham组相比，MCAO组超氧阴离子荧光强度明显增加；与MCAO组相比，EA+MCAO组荧光强度明显降低；与EA+MCAO组相比，而EA+SOD2-siRNA组荧光强度明显增加。 3. SOD2-siRNA逆转电针预处理的脑保护效应神经行为学评分：与MCAO组相比， EA+MCAO组神经行为学评分明显降低（P0.05）；与EA+MCAO组相比，而EA+SOD2-siRNA组神经行为学评分明显升高（P0.05）。脑梗死容积百分比：与MCAO组相比， EA+MCAO组的脑梗死容积百分比明显减小（P0.05）；与EA+MCAO组相比，EA+SOD2-siRNA组脑梗死容积百分比明显增大（P0.05）。TUNEL染色:与MCAO组相比，EA+MCAO组凋亡细胞数目明显减少（P0.05）；与EA+MCAO组相比，EA+SOD2-siRNA组凋亡细胞数目明显升高（P0.05）。结论电针预处理通过上调小鼠脑缺血再灌注后SOD2表达，减轻氧化应激损伤，抑制缺血后神经元凋亡从而诱导脑缺血耐受。实验三电针预处理通过CB1受体介导STAT3磷酸化上调SOD2 目的 1.验证大麻素CB1受体在电针预处理上调缺血再灌注损伤后SOD2表达中的作用 2.明确转录因子STAT3在电针预处理上调缺血再灌注损伤后SOD2表达中的作用方法 1. CB1受体抑制剂AM251、SR141716对电针预处理后SOD2表达的影响将30只雄性C57BL/6小鼠分为5组：模型组（MCAO组）、电针预处理组（EA+MCAO组）、AM251预处理组（EA+AM251组）、SR141716预处理组（EA+SR141716组）、溶剂组（EA+vehicle组），其中MCAO组、EA+MCAO组处理方法如前所述；EA+AM251组、EA+vehicle组:分别给予AM251（1mg/kg）和溶剂腹腔注射30min后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，持续电针30min，电针后2h进行MCAO模型，大脑中动脉缺血1h后再灌。EA+SR141716组：麻醉后，持续电针30min，电针后2h进行MCAO模型，模型后30min给予SR141716（1mg/kg），缺血1h后再灌。所有小鼠缺血再灌注2h后取缺血半暗带进行western-blot。 2. CB1受体激动剂ACEA、WIN55,212-2对小鼠脑缺血再灌注后SOD2表达的影响将30只雄性C57BL/6小鼠分为5组：模型组（MCAO组）、电针预处理组（EA+MCAO组）、ACEA预处理组（MCAO+ACEA组）、WIN55,212-2预处理组（MCAO+WIN组）、溶剂组（MCAO+vehicle组），其中MCAO组、EA+MCAO组、处理方法如前所述；MCAO+ACEA组、MCAO+WIN组、MCAO+vehicle组:分别给予ACEA（2.5mg/kg）、WIN55,212-2（1.5mg/kg）和溶剂腹腔注射30min后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，进行MCAO模型，大脑中动脉缺血1h后再灌。缺血再灌注2h后取缺血半暗带进行western-blot。 3.电针预处理对小鼠脑缺血再灌注后STAT3磷酸化水平的影响将24只雄性C57BL/6小鼠分为4组：假手术组（sham组）、单纯电针组（EA组）、模型组（MCAO组）、电针预处理组（EA+MCAO组），其处理方法如前所述。缺血再灌注2h后取材，进行western-blot观察STAT3磷酸化水平变化情况。 4. CB1受体抑制剂AM251、SR141716对电针预处理后pSTAT3水平的影响将30只雄性C57BL/6小鼠分为5组：模型组（MCAO组）、电针预处理组（EA+MCAO组）、AM251预处理组（EA+AM251组）、SR141716预处理组（EA+SR141716组）、溶剂组（EA+vehicle组），其处理如前所述。缺血再灌注2h后取缺血半暗带进行western-blot。 5. CB1受体激动剂ACEA、WIN55,212-2对小鼠脑缺血再灌注后pSTAT3水平的影响将30只雄性C57BL/6小鼠分为5组：模型组（MCAO组）、电针预处理组（EA+MCAO组）、ACEA预处理组（MCAO+ACEA组）、WIN55,212-2预处理组（MCAO+WIN组）、溶剂组（MCAO+vehicle组），其处理方法如前所述。缺血再灌注2h后取缺血半暗带进行western-blot。结果 1. CB1受体抑制剂AM251、SR141716可下调电针预处理后SOD2的表达给予CB1受体抑制剂AM251、SR141716后，western-blot结果显示与MCAO组相比，EA+MCAO组SOD2表达均明显增加（P0.05）；与EA+MCAO组相比，EA+AM251组和EA+SR141716组SOD2表达均明显降低（P0.05）。 2. CB1受体激动剂ACEA、WIN55,212-2可上调小鼠脑缺血再灌注后SOD2的表达给予CB1受体激动剂ACEA、WIN55,212-2后，western-blot结果显示与MCAO组相比，MCAO+ACEA组、MCAO+WIN组SOD2表达明显增加（P0.05）。 3.电针预处理对小鼠脑缺血再灌注后STAT3磷酸化水平的影响缺血再灌注2h后，与sham组相比，EA组pSTAT3水平无明显变化，而MCAO组pSTAT3表达明显下降（P0.05）；与MCAO组相比， EA+MCAO组pSTAT3表达明显升高（P0.05）。 4. CB1受体抑制剂AM251、SR141716可降低电针预处理后pSTAT3水平给予CB1受体抑制剂AM251、SR141716后，结果显示与MCAO组相比，EA+MCAO组pSTAT3水平均明显升高（P0.05）；与EA+MCAO组相比，EA+AM251组和EA+SR141716组pSTAT3水平均明显降低（P0.05）。 5. CB1受体激动剂ACEA、WIN55,212-2可升高小鼠脑缺血再灌注后pSTAT3水平给予CB1受体激动剂ACEA、WIN55,212-2后，结果显示与MCAO组相比，MCAO+ACEA组、MCAO+WIN组pSTAT3水平明显升高（P0.05）。结论电针预处理通过CB1受体促进STAT3磷酸化水平，从而上调SOD2表达发挥脑保护作用。小结本实验采用雄性C57BL/6小鼠大脑中动脉栓塞模型，首先通过western-blot和免疫荧光结果证实了电针预处理上调小鼠缺血再灌注2h后神经元SOD2表达。随后侧脑室注射给予SOD2-siRNA，发现SOD2-siRNA可以逆转电针预处理的抗氧化作用以及脑保护效应，进一步证实电针预处理激活SOD2减轻氧化应激损伤诱导脑缺血耐受。那么，电针预处理上调SOD2表达发挥脑保护效应的机制又是什么？针对这一问题，接下来实验给予CB1受体的抑制剂和激动剂，证实电针预处理通过CB1受体促进STAT3磷酸化水平，从而上调SOD2表达。总之，本研究发现电针预处理通过CB1受体促进STAT3磷酸化，上调脑缺血后SOD2表达，从而减轻氧化应激损伤，抑制缺血后神经元凋亡从而发挥脑保护作用。这一研究结果不仅为揭示电针预处理脑保护措施分子机制做出贡献，也为其临床应用推广提供更多基础实验证据，奠定坚实理论基础。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R246.2

【参考文献】