miR-22对心肌细胞自噬和凋亡的调控研究

发布时间：2018-04-21 23:02

本文选题：微小核糖核酸 + 饥饿　；参考：《第二军医大学》2016年博士论文

【摘要】：一、背景与目的缺血性心脏病,尤其是急性心肌梗死已成为世界范围内人类死亡的主要原因之一。虽然近些年急诊PCI技术的发展和广泛应用使得急性心肌梗死的死亡率明显下降,但由于成年心脏心肌细胞几乎丧失了再生能力,所以心肌梗死后心脏不会通过心肌细胞的再生来修复,进而心脏会发生心室重构最终导致心力衰竭。因此维持缺血心肌细胞的存活对于急性心肌梗死的预后至关重要。研究发现心肌梗死发生时缺血区域既发生心肌细胞自噬也发生心肌细胞凋亡。自噬和凋亡在哺乳动物发育以及细胞稳态的维持中均发挥重要作用。自噬是细胞重要的分解代谢通路,它通过降解和回收细胞质中长寿命的蛋白和衰老的细胞器等来维持细胞的存活。研究发现激活心肌细胞自噬能减小心肌梗死过程中梗死心肌的面积。凋亡是细胞死亡的一种形式,它是由基因控制的细胞自主有序的死亡。研究报道抑制心肌细胞凋亡能减少心肌梗死过程中心肌细胞的损失,从而改善心梗后心脏功能。所以,适当调控心梗过程中心肌细胞的自噬和凋亡对于心脏功能的维持具有重要意义。miRNA是一种小分子非编码RNA,主要通过转录后水平调控基因的表达。研究发现一些miRNA,如miR-145、miR-15和miR-24等,参与调控心肌梗死过程中心肌细胞自噬和凋亡。miR-22是一种在心脏中高表达的mi RNA,是心室重构的重要调节因素。本课题中我们发现EBSS饥饿处理后心肌细胞出现了明显的自噬和凋亡,此外miR-22的表达也明显下调,说明miR-22可能参与调控EBSS饥饿引起的心肌细胞自噬和凋亡。我们对心肌细胞过表达和敲低miR-22来观察自噬和凋亡活性的变化。此外,我们还构建小鼠心梗模型来在体评估miR-22对心肌自噬和凋亡的调控。同时我们也探讨了miR-22调控饥饿诱导的心肌细胞自噬和凋亡的潜在靶基因。二、研究方法(一)乳鼠心肌细胞分离和培养新生2天的SD大鼠表面消毒后取出心脏,D-hanks洗涤心脏,去除心房结构,将心室剪成1mm3的组织块,然后用1%的I型胶原酶5ml 4℃冰消化过夜(18h),然后放入细胞培养箱消化5-10分钟并吹打组织块直至消化完全,加入完全DMEM培养液终止消化,离心后D-hanks液重悬洗涤并再次离心,沉淀用培养基重悬后采用差速贴壁分离出心肌细胞。以0.1mM BrdU的DMEM培养液培养心肌细胞,以ebss培养构建心肌细胞饥饿模型。(二)实时定量pcr(qrt-pcr)大鼠心肌细胞总rna由trizol方法抽提,经逆转录为cdna。qrt-pcr按照sybrgreeni法进行,u6作为内参。(三)腺病毒构建及细胞转染mir-22过表达腺病毒的构建按adeasy腺病毒包装系统具体方法实施,腺病毒滴度按细胞病变(cpe)法测定。mir-22inhibitor经lipofectamine2000包装后转入心肌细胞。controlinhibitor转染的心肌细胞作为阴性对照。采用qrt-pcr检测mir-22过表达腺病毒和mir-22inhibitor转染效率。(四)蛋白免疫印迹检测(westernblot)采用westernblot分析心肌细胞中蛋白lc3、p62、p38α和gapdh的表达水平。心肌细胞经含有pmsf的ripa裂解液裂解后提取蛋白。测定蛋白浓度后配平上样,常规sds-page电泳,1h湿转。然后用5%脱脂牛奶封闭,孵育一抗4℃过夜,室温孵育二抗1h。odyssey红外激光扫描条带,并用软件分析蛋白条带。(五)细胞免疫荧光和免疫组化染色细胞按实验设计接受不同处理后,用4%多聚甲醛室温固定10min,用0.1%tritonx-100室温透膜10min,然后用5%山羊血清室温封闭30min,加anti-lc3抗体室温下孵育1h,pbst清洗3次,加入抗兔igg二抗室温避光孵育30min。0.1%dapi染核,封片,然后激光共聚焦显微镜下观察拍照。心脏免疫组化染色,心肌组织经4%多聚甲醛固定24h后石蜡包埋并切片。石蜡切片脱蜡并逐渐水合,然后用5%的山羊血清封闭10min,4?°c孵育anti-lc3和anti-p62一抗过夜,加入二抗孵育1h,显色剂显色并封片。(六)小鼠心梗模型构建balb/c小鼠麻醉后气管插管接呼吸机,潮气量设置为3ml,呼吸频率150次/分,吸呼比设置为2:1,连接模拟心电仪。消毒铺巾,在左胸处剪开约lcm长的皮肤切口;钝性分离皮下肌肉,暴露肋骨,延第四肋间隙剪开肋间肌,进入胸腔,用撑开器撑开肋骨,沿心底部剪开心包,探查左心耳,使用8-0眼科带针缝线,于左心耳下方2~3mm中外1/3进针,左心耳右侧外源出针,打结。结扎后心脏前壁局部颜色转为苍白,心电图示st段抬高。逐层关胸。(七)流式细胞检测心肌细胞按实验设计处理完毕后,应用不含edta的胰酶消化收集细胞,离心后用预冷的pbs洗涤细胞两次,再次离心后弃上清加入500μl的1×bindingbuffer再次悬浮细胞。加入5μlannexinv-apc或annexinv-fitc混匀后,室温避光孵育15min。加入3μlpi混匀,避光孵育5min。将细胞转入上样管进行仪器检测和分析。(八)tunel和masson染色心肌细胞凋亡是通过tunel染色检测,tunel染色主要通过凋亡检测试剂盒来完成,具体步骤详见说明书。在10个随机的高倍镜视野下计数tunel阳性细胞和心肌细胞总数。tunel阳性细胞数占总心肌细胞数的百分比定量心肌细胞凋亡率。利用masson染色检测心肌纤维化。masson染色主要用masson染色试剂盒完成,具体步骤详见说明书。(九)双荧光素酶报告基因将含有野生型和突变型p38αmrna3’utr的荧光素酶质粒分别与mir-22类似物共转染至293t细胞。转染48h后裂解293t细胞,分别检测萤火虫萤光素酶的活力和海肾荧光素酶活性,计算两者的比值并进行统计分析。(十)统计学分析使用graphpadprism对数据进行统计分析,数据以平均值±标准误表示。使用两独立样本t检验对实验组和对照组数据进行比较。以p0.05作为显著性差异标准。三、结果(一)饥饿诱导心肌细胞自噬使用ebss饥饿处理4h后心肌细胞自噬水平显著升高。westernblot提示饥饿4h时lc3-ii/i的比值明显升高,显著高于正常培养组,而p62水平则显著低于正常培养组。免疫荧光检测观察到饥饿处理4h的心肌细胞内的lc3红色荧光小点聚集在细胞质中,而荧光小点被视为自噬的标志。这些结果说明ebss饥饿成功诱导了心肌细胞发生自噬。定量pcr结果显示与正常培养组相比,ebss饥饿处理后mir-22的表达明显下调,其中饥饿处理4小时mir-22下调最为明显。(二)mir-22促进饥饿诱导的心肌细胞自噬我们首先利用mir-22过表达腺病毒转染心肌细胞实现mir-22过表达,qrt-pcr结果显示mir-22腺病毒转染的心肌细胞中mir-22的表达量升高了14倍,说明mir-22腺病毒的高效性。然后腺病毒转染心肌细胞48h后继续用ebss饥饿诱导自噬,westernblot检测结果显示mir-22过表达后lc3-ii/i的比值显著提高,同时p62的水平明显下降,免疫荧光检测也发现mir-22过表达后心肌细胞内红色荧光点的数量明显增多。上述结果说明过表达mir-22促进了饥饿诱导的心肌细胞自噬。此外小鼠心梗模型中mir-22过表达的心肌中lc3水平更高而p62水平更低,说明mir-22过表达后心肌中的自噬水平也明显升高。为进一步从反面验证mir-22对自噬的影响,我们使用mir-22inhibitor处理心肌细胞。qrt-pcr结果显示mir-22inhibitor转染后mir-22被明显下调。westernblot显示下调mir-22的表达能显著减少lc3-ii/i的比值,但能增加p62的水平。免疫荧光检测同样发现mir-22下调后心肌细胞内的红色荧光点明显减少。因此上述结果提示mir-22能提高饥饿诱导的心肌细胞自噬活性。(三)mir-22抑制饥饿诱导的心肌细胞凋亡。除了发生心肌细胞自噬,ebss培养的心肌细胞也出现了明显的凋亡。流式细胞检测发现在相同的饥饿条件下与对照组相比,mir-22过表达的心肌细胞发生更少的凋亡,表现出更低的凋亡率。为了研究内源性mir-22对于心肌细胞凋亡的调控作用,我们同样利用mir-22inhibitor敲低心肌细胞内的mir-22的水平,同时以controlinhibitor做为阴性对照。结果发现在相同的饥饿条件下与对照组相比,mir-22下调后的心肌细胞发生更明显的凋亡,表现出更高的凋亡率。此外在小鼠心梗模型中,与对照组相比,mir-22过表达的心肌表现出更少的tunel阳性的凋亡细胞,说明mir-22过表达后抑制了缺血引起的心肌细胞凋亡。这些结果说明mir-22能抑制饥饿诱导的心肌细胞凋亡。(四)mir-22通过抑制p38α表达调控心肌细胞自噬和凋亡。我们利用生物学信息数据库筛选mir-22在心肌细胞中的潜在靶基因,发现p38α是mir-22的潜在的靶基因。生物信息学检索发现p38α的3’utr含有mir-22的可能的结合位点。因此我们首先利用双荧光素酶报告系统验证p38α是否是mir-22的靶基因。结果显示过表达mir-22可以抑制携带野生型p38α3'-utr序列载体的萤火虫荧光素酶活性,但对携带p38α3'-utr突变序列的载体的萤火虫荧光素酶活性无影响,证实了p38α是mir-22的直接靶基因。westernblot也进一步验证了在过表达mir-22后p38α蛋白的表达显著受到抑制,而敲低mir-22后能促进P38α蛋白的表达。上述结果均提示miR-22可能通过靶向p38α对心肌细胞自噬和凋亡起调控作用。四、结论(一)EBSS平衡盐溶液饥饿处理心肌细胞能够成功诱导离体的大鼠心肌细胞发生自噬。(二)在心肌细胞饥饿模型中,心肌细胞中miR-22的表达显著下降,且在饥饿4h时下降最为明显。(三)过表达miR-22能显著促进饥饿诱导的心肌细胞自噬,而敲低miR-22后则能抑制心肌细胞自噬的活性。(四)过表达miR-22能显著抑制饥饿诱导的心肌细胞凋亡,而敲低miR-22后则能促进心肌细胞凋亡的发生。(五)miR-22靶向作用于p38α并直接抑制p38α的表达,并可能通过这条途径促进了饥饿诱导的心肌细胞自噬,抑制了饥饿诱导的心肌细胞凋亡。
[Abstract]:In this study , it is important to study the effect of miR - 22 on myocardial apoptosis in myocardial infarction . ( 4 ) The expression level of protein lc3 , p62 , p38伪 and gapdh in myocardial cells was analyzed by Western blot . ( 6 ) Mouse heart stem model was used to construct balb / c mice after anesthesia , the tracheal intubation was connected to the ventilator , tidal volume was set to 3 ml , respiratory rate was 150 times / min , the inspiratory and expiratory ratio was set to 2 : 1 , and then the cells were isolated from the left atrial appendage . The results showed that the expression of mir - 22 was significantly higher than that in normal culture group . The results showed that the expression of mir - 22 was significantly higher than that in normal culture group . ( 3 ) overexpression of miR - 22 can significantly promote the autophagy of cardiomyocytes induced by hunger , and the activity of autophagy of myocardial cells can be inhibited after the miR - 22 is knocked down , and ( IV ) overexpression of miR - 22 can significantly inhibit the apoptosis of myocardial cells induced by hunger .

【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R54

【相似文献】