虎杖苷通过抑制细胞内在凋亡信号改善内毒素介导的血管通透性增加

发布时间：2018-04-22 23:29

本文选题：脂多糖 + 脓毒症　；参考：《南方医科大学》2014年硕士论文

【摘要】：脓毒症(Sepsis)是感染引起的全身炎症反应综合征,是目前重症医学研究的热点和难点。内皮细胞激活、功能障碍和损伤是严重脓毒症及多器官功能障碍综合征(MODS)的重要特征。内皮通透性增高所致微血管渗漏是严重脓毒症和MODS的重要病理生理,也是脓毒症休克顽固性低血压的原因之一。内皮细胞损伤是血管通透性增加的关键环节。脓毒症诱导产生的TNF-α、IL-1β等炎症介质及其他损伤因子的释放,损害内皮细胞,血管内皮的结构和完整性受到破坏,引起血管通透性增加。最近有研究证明,线粒体凋亡信号激活在血管通透性增加的过程中发挥了重要作用。线粒体依赖途径凋亡即各种因素导致线粒体受损,线粒体通透性转变孑L(mPTP)开放,通过释放Cytochrome C及SMAC等小分子凋亡促进蛋白进入细胞质,通过Caspases级联反应进而激活Caspase-3,导致细胞凋亡。激活的Caspase-3可以裂解众多底物,其中包括内皮间链接蛋白β-catenui。 β-catenin链接了细胞骨架蛋白Actin与VE-cadherin,裂解β-catenin导致Actin与VE-cadherin链接断裂从而使得内皮间链接打开,血管通透性增加。在线粒体依赖途径凋亡信号中,线粒体起着关键调控作用,各种损伤因子导致线粒体受损,功能障碍,最终引起线粒体通透性转变孔(mPTP)开放,mPTP的开放导致小分子的物质释放,引起线粒体膜电位(△Ym)丢失,线粒体肿胀、功能障碍,ATP合成障碍。在线粒体损伤的众多因素中,氧自由基是最为重要的一个。线粒体是活性氧产生的重要部位,病理情况下,氧自由基清除功能降低,而生成系统活性增强,氧自由基便大量产生堆积,从而损伤细胞。一方面氧自由基可以直接损伤线粒体膜结构及线粒体DNA,另一方面活性氧还可调控Bcl-2家族蛋白表达。Bcl-2家族蛋白由抗凋亡如Bcl-2, Bcl-XL和促凋亡成员如Bax, Bak组成,这些成员之间通过相互协同作用调节了线粒体结构与功能的稳定性。当细胞受到凋亡刺激后,Bax发生构象变化,通过在线粒体外膜上齐聚形成脂质孔,使得线粒体外膜通透性增加,引起细胞色素C等蛋白释放及导致下游caspases激活。Bcl-2家族抗凋亡蛋白成员通过与促凋亡蛋白成员Bax和Bak形成异源二聚体而抑制Bax和Bak的促凋亡作用,从而维持线粒体膜稳定。目前临床上尚无明显改善血管通透性增高的有效治疗手段或药物,在脓毒症导致的微血管渗漏进而引起血管内液体转移而休克的治疗中,大多采用基于液体治疗的基础上进行病因治疗,但是效果甚微而慢,并且在血管通透性增加未得到改善的时候,大量补液反而加重水肿,进一步加重微循环障碍。因此,探索寻求一种可减轻炎症反应,降低血管通透性,进而改善微循环的药物具有十分重要的意义。虎杖苷(polydatin, PD)是虎杖的有效活性成分,其化学名为3,4’,5.三羟基芪-3-13-D-单葡萄糖苷(3,4,5-trihydroxystilbene-3-B-mono-D-glucoside) c经过30年的研究,表明PD可以改善休克微循环,抑制白细胞粘附,具有显著的抗炎抗氧化作用。近年来本实验室证明PD可以通过抑制氧化应激,稳定溶酶体,抑制mPTP开放而保护线粒体。因此假设PD可以通过抑制线粒体依赖途径凋亡信号而改善内毒素(LPS)介导的血管通透性增加。目的本实验通过在体水平研究虎杖苷对LPS介导的大鼠肠系膜微静脉血管通透性增高以及离体水平研究虎杖苷对LPS介导的人脐静脉内皮细胞(]HUVECs)通透性增高的影响,探讨虎杖苷在脓毒症中血管通透性增加的作用。并通过研究虎杖苷对LPS介导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)线粒体凋亡信号的影响,探讨虎杖苷抑制LPS介导的血管通透性增高的机制。方法 1.LPS介导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)通透性增高实验分为对照组(control group),不同浓度内毒素(0.1、1.0、5.0、10.0mg/L)刺激组。分别给予PBS及0.1、1.0、5.0、10.0mg/L LPS刺激HUVECs,通过每30min检测跨内皮细胞电阻(TER)观察LPS对HUVECs通透性的影响。2.PD对LPS诱导的HUVECs通透性增加的影响 PD对LPS介导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)通透性增高的影响：实验分为对照组(control group).内毒素+平衡盐溶液组(LPS+PBS group).内毒素+低剂量虎杖苷组(LPS+low-dose PD group).内毒素+中剂量虎杖苷组(LPS+medium-dose PD group)及内毒素+高剂量虎杖苷组(LPS+high-dose PD group).不同剂量虎杖苷处理组分别在予以终浓度虎杖苷1、10及100μmol/L预处理60min后给予LPS5mg/L的刺激。通过每15min测量一次跨内皮细胞电阻(TER)检测60min内PD对LPS介导的HUVEC通透性增高的影响.3.PD对LPS介导的HUVECs线粒体凋亡信号的影响实验分为对照组(control group)、内毒素+平衡盐溶液组(LPS+PBS group).内毒素+虎杖苷组(LPS+PD group)。虎杖苷治疗剂量根据PD对LPS介导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)通透性增高的影响实验结果,采用预处理终浓度为10μmol/L.通过过氧化脂质(LPO)试剂盒检测HUVECs中氧化应激水平；蛋白免疫印迹法检钡HUVECs中BAX蛋白及Bcl-2蛋白表达改变；荧光素—荧光素酶试剂盒来检测HUVECs线粒体ATP水平；JC-1探针来检测细胞线粒体跨膜电位(△Ψm)的变化,用发射的绿色荧光的JC.1单体(低△Ψm细胞)的细胞百分数(%)来说明HUVECs线粒体去极化比例；细胞色素C凋亡试剂盒检测HUVECs细胞质中细胞色素C含量；caspsse-3活性分析试剂盒检测HUVECs中caspsse-3活性。 4.PD对内毒素介导的肠系膜微静脉血管通透性增高的影响实验分为对照组(control group),内毒素+生理盐水组(LPS+NS group),内毒素+虎杖苷组(LPS+PD group).大鼠麻醉后,股静脉及动脉置管,通过静脉给予LPS10mg/kg,并通过股动脉监测大鼠平均动脉压(MAP),虎杖苷组大鼠在LPS注射后立即给予虎杖苷45mg/kg治疗。3小时后,剖腹并在正置荧光显微镜、实验室分析软件ⅡS.Element BR观察分析1小时内小肠系膜微静脉荧光白蛋白渗出情况,并计算荧光值变化即△I=1-(Ii-Io)/Ii,其中Ii代表血管内平均荧光强度,I0代表血管外平均荧光强度,△I越大通透性越高。结果 1.LPS介导的HUVECs通透性增加的浓度和时间效应为了检测不同浓度LPS对HUVECs通透性的影响,本研究分别采用了0、0.1、1.0、5.0、10.0mg/L等浓度的LPS刺激HUVECs,通过每30min检测内皮细胞跨膜电阻(TER)可见,0.1mg/L的LPS并不引起HUVECs通透性的明显增加,而1.0、5.0、10.0mg/L均可引起HUVECs通透性的显著增加,并且均在60min达到峰值后维持稳定,在60min时,5.0及10.0mg/L LPS组TER明显低于1.0mg/L LPS组,而5.0与10.0mg/L LPS组间无明显差异。 2.PD对LPS诱导的HUVECs通透性增加的影响分别以1、10、100μmol/L的PD提前60min预处理HUVECs后,给予终浓度为5.0mg／L的LPS刺激,在60min内每15min检测内皮细胞TER,实验结果可见,LPS刺激后HUVECs通透性明显增加,而给予1、10、100μmol/L的PD预处理组中,可见TER不同程度增加,即通透性不同程度降低。其中10、100gmol/L的PD预处理组中可见TER明显增加。在60min时,10、100μmol/L的PD预处理组中TER均明显高于PBS组及1μmol/L PD处理组(P0.01或者P0.05),提示10、100μmol/L的PD预处理可以显著改善LPS诱导的HUVECs通透性增加,而通过比较发现10与100μmol/L两组间TER无明显差异(P0.05)。 3.PD对HUVECs中过氧化脂质(LPO)的影响为了检测氧化应激在LPS介导的HUVECs通透性增加以及PD的干预作用,本研究采用了LPO试剂盒检测细胞中LPO含量。结果显示LPS刺激60min后HUVECs中LPO含量明显高于对照组,为对照组的177±21%(P0.05)；而PD预处理组中HUVECs LPO含量为对照组的130±16%,较PBS组显著降低(P0.05)。提示LPS引起HUVECs氧化应激,而PD可以显著抑制氧化应激。 4.PD对HUVECs BAX蛋白及Bcl-2蛋白表达的影响 Bcl-2家族蛋白对于线粒体通透性转变孔的调控尤为重要,而Bcl-2家族蛋白主要包括促凋亡蛋白如Bcl-2、Bcl-xl等,以及抗凋亡蛋白BAX.BAD等。通过蛋白免疫印迹实验可见,PBS组中促凋亡蛋白BAX表达明显提高,抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达显著下降(P0.05),提示LPS诱导HUVECs中Bcl-2蛋白家族表达异常,促进HUVECs凋亡；而PD组中可见BAX表达较PBS组明显降低,Bcl-2蛋白表达较PBS组显著增加(P0.05),提示PD可以显著改善LPS诱导的Bcl-2蛋白家族表达异常,从而抑制HUVECs凋亡。 5.PD对HUVECs线粒体膜电位(△Ψm)的影响用流式细胞仪检测荧光探针JC-1标记的HUVECs线粒体膜电位(△Ψm)的改变。PD对HUVECs线粒体膜电位(△Ψm)的影响JC-1是一种电位敏感性荧光探针,在正常线粒体以聚合体形式存在,发橘红色荧光,提示线粒体处于极化状态；在疾病等情况下,JC-1以单体形式存在,发绿色荧光,提示线粒体去极化,跨跨膜电位减低。计数JC-1单体(绿色荧光)标识的低△Ψm细胞的比例。对照组中,低△Ψm细胞的比例为11.3±3.0%；PBS组中低△Ψm细胞的比例为27.5±5.1%,较对照组显著提高(P0.05),提示LPS刺激引起线粒体膜电位下降；PD组中低△Ψm细胞的比例为17.3±3.6%较PBS组明显降低(P0.05),提示PD显著抑制LPS诱导的细胞线粒体膜电位下降。 6.PD对HUVECs ATP含量的影响 ATP是线粒体功能评价的直接指标。本研究采用CellTiter-GlO荧光素酶生物发光法,检测细胞内ATP含量。结果显示,PBS组中ATP含量较对照组显著降低(P0.05),为对照组的43.7±19.0%,提示PBS介导线粒体损伤引起ATP合成降低；PD组中ATP含量较PBS组显著提高(P0.05),为对照组的82±13.7%,提示PD抑制LPS诱导的线粒体损伤。 7.PD对HUVECs线粒体中细胞色素C释放的影响细胞色素C是存在于线粒体中的蛋白,线粒体损伤致使通透性转变孔开放后,细胞色素C由线粒体释放进入细胞质,激活caspases级联反应从而引起细胞凋亡。通过细胞色素C凋亡试剂盒检测发现,在对照组中,细胞色素C含量甚微,而LPS刺激后,引起线粒体损伤及通透性转变孔开放,导致细胞色素C释放而使得细胞质中细胞色素C含量明显增加；蛋白免疫印迹结果显示PD组中细胞色素C含量较PBS组明显降低,几乎恢复正常,提示PD可以通过保护线粒体显著抑制细胞色素C的释放,从而抑制细胞凋亡。 8.PD对HUVECs caspsse-3活性的影响凋亡信号激活后,细胞色素C等蛋白由线粒体释放进入胞浆,从而激活下游caspases,其中caspase-3是比较重要的凋亡执行蛋白。本实验采用试剂盒荧光分析法检测HUVECs中caspase-3活性变化。实验结果显示,PBS组中caspase-3活性较对照组显著提高,为对照组的221±29%；PD组中caspase-3活性较PBS组显著提高,为对照组的175±21%,提示PD抑制LPS介导的caspase-3激活。 9.PD减轻LPS大鼠的肠系膜微静脉血管渗漏在整个实验过程中,用PowerLab//8sp监测三组大鼠平均动脉压(MAP)发现组间血压没有统计学差异。本实验通过同等外周环境条件下在体实验观察异硫氰酸荧光素标志的白蛋白在肠系膜毛细血管内外的荧光密度值对比,结果显示LPS可引起微血管,尤其是毛细血管后微静脉渗透性显著增高,而LPS+PD治疗组荧光蛋白外渗情况较LPS+NS对照组减轻,测定的T60的Io值,正常对照组为0.21±0.14,LPS+NS组上升为0.60±0.09(P0.01),LPS+PD组为0.34±0.05(P0.01),两组LPS组间对比具有统计学差异(P0.01)。结论 1.虎杖苷抑制LPS介导的人脐静脉内皮细胞通透性增高； 2.虎杖苷通过抑制线粒体凋亡信号改善LPS介导的人脐静脉内皮细胞通透性增高； 3.虎杖苷抑制LPS诱导的大鼠肠系膜微静脉血管通透性增高。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R459.7

【参考文献】