cRGD-siEGFR分子肿瘤靶向性及其抗恶性胶质瘤的体内外作用研究

发布时间：2018-04-24 13:50

本文选题：cRGD-siRNA + 肿瘤靶向　；参考：《南方医科大学》2016年博士论文

【摘要】：研究背景近年来癌症已成为威胁人类生命与健康的主要致死疾病,对癌症的有效防治已是全球共同面临的难题。目前,手术、放化疗是治疗癌症的常规手段,但存在不良反应多、对人体损伤大以及治疗效果不理想等问题。近年来,新型的肿瘤分子靶向药物逐渐进入临床,因其具有特异性强、耐受性好、毒副作用相对小等特点,分子靶向药物已成为临床治疗肿瘤的重要手段。表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor, EGFR)是一种细胞外蛋白配体的细胞表面受体。已有大量研究表明,EGFR的异常表达,可激活与肿瘤增殖、分化相关的基因,在肿瘤的发生和发展过程中起着极其重要的作用。目前靶向EGFR的酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)是当今肿瘤药物研发的重要方向。临床上针对EGFR的肿瘤靶向药物主要分三类：小分子靶向药物、单克隆抗体和肿瘤疫苗,如常用的西妥昔单抗、帕尼单抗等。肿瘤靶向药物的问世为临床治疗肿瘤发挥了巨大的作用,但随着临床的广泛应用,与这些靶向药物相关的严重不良反应不断涌现,且逐渐产生的耐药性问题已成为肿瘤靶向药物研究的又一个挑战,如何满足迫切的临床需求,研发新型的肿瘤靶向药物变得尤为重要。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是近年发展起来的一种新技术。RNAi是指通过外源性或内源性的双链RNA在体内诱导靶基因mRNA产生特异性降解,进而发挥特异性的基因沉默作用,目前全球已有近60个关于肿瘤和病毒感染的siRNA药物进入到临床试验阶段,RNAi作为一种全新的药物分子展示了巨大的临床应用前景。通过搜索国际上重要的临床试验注册数据库,如美国ClinicalTrials.gov、世界卫生组织临床试验注册平台(ICTRP)等,暂未见以EGFR为靶点的siRNA药物的临床注册,因此利用现代生物学技术开发针对EGFR为靶点的siRNA药物具有一定的研究价值和创新性,而且还蕴藏着巨大的潜力和临床应用前景。整合素(integrin)是一种介导细胞核与外环境之间连接的跨膜受体。作为细胞粘附分子家族的重要成员之一,主要介导细胞之间、细胞与胞外基质之间的粘附,在许多恶性肿瘤细胞表面高表达,但在大多数正常的静止期细胞和组织中几乎不表达,其亚型为αvβ3,。现有研究已证实多肽RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)可以被αvβ3受体特异性的识别,且环状RGD (cRGD)对αvβ3受体的亲和力、特异性更高。因此,可以利用cRGD与肿瘤细胞表面高表达的αvβ3受体特异性结合、经受体内吞携带药物分子进入细胞内的特点,人工合cRGD-siEGFR分子,研发可特异性靶向肿瘤细胞并沉默EGFR mRNA表达的新型肿瘤分子靶向药物,这将具有非常重要的研究意义和临床价值。综上所述,我国恶性肿瘤患者日益增加,目前尚无治愈肿瘤的特效药物,常规的治疗手段毒副作用大,疗效不理想,新型的肿瘤靶向药物虽然从一定程度上显示了临床疗效,但仍存在较多严重不良反应,而且现有的靶向药物仅局限于非小细胞肺癌和乳腺癌等几个病症,加上日益严重的耐药问题已成为这些药物的应用瓶颈,更多的新型肿瘤靶向药物亟待开发,新兴的RNAi技术为新型肿瘤靶向药物的研究提供了新的手段,为新型高效低毒的肿瘤靶向药物研发带来了希望。目前国际上重要的临床试验注册数据库ClinicalTrials.gov、世界卫生组织临床试验注册平台(ICTRP)等,暂未见以EGFR为靶点的siRNA药物的临床注册,参考文献中也未见以cRGD为靶向配体、EGFR为靶点的siRNA药物研究报道,因此通过人工合成cRGD-siEGFR分子,研发可特异性靶向肿瘤细胞并沉默EGFR表达的新型肿瘤分子靶向药物,这将具有非常重要的研究意义和临床价值。本论文拟将cRGD肽通过小分子量PEG接头直接共价偶联到特异性沉默EGFR siRNA正义链的末端,得到可特异性沉默肿瘤细胞EGFR mRNA表达的cRGD-siEGFR分子,并考察该分子特异性沉默EGFR mRNA和蛋白的作用、肿瘤靶向性、抗肿瘤活性及其毒副作用和免疫刺激反应,并进一步对肿瘤组织切片,进行免疫组化和TUNEL分析,验证cRGD-siEGFR分子抑制肿瘤细胞增值、诱导肿瘤细胞凋亡的作用,以及对机体各脏器和组织的毒副作用,探讨cRGD-siEGFR分子作为新型肿瘤分子靶向药物的可行性及其存在的优缺点,也为类似的RNAi药物研究提供参考。目的1.筛选验证有效沉默EGFR mRNA表达的siRNA序列及其骨架修饰方式。2.合成cRGD-siEGFR分子并且对其结构和纯度进行鉴定分析。3.体外研究cRGD-siEGFR分子的血浆稳定性。4.体外研究cRGD-siEGFR分子的细胞靶向性,细胞毒性及其特异性沉默EGFR mRNA表达的功能。5.荷瘤裸鼠模型研究cRGD-siRNA分子的肿瘤靶向性及其在体内的代谢分布。6.荷瘤裸鼠模型研究cRGD-siRNA分子抗肿瘤生长的生物学活性及其相关机制(基因沉默效率和肿瘤细胞凋亡情况)；7.荷瘤裸鼠模型研究cRGD-siRNA分子对免疫原性和肝肾功能的影响。方法1. EGFR siRNA序列验证和骨架修饰通过RT-qPCR法进行对EGFR siRNA序列沉默EGFR mRNA的效率进行验证,并对验证后的序列进行骨架修饰,主要通过对EGFR siRNA正义链或反义链的5’或3’端进行甲氧基修饰以及关键位置的U替换为T,以提高siRNA的稳定性,降低免疫原性和脱靶效应。2. cRGD-siEGFR分子的合成将cRGD肽的氨基与8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(PEG)的羧基脱水缩合,得到cRGD-PEG,再与3-Maleimidopropionic Acid (MPA)的羧基脱水缩合,得到cRGD-PEG-MPA,最后通过巯基与EGFR siRNA分子正义链的5’端共轭连接,得到人工合成的cRGD-siEGFR。LC-MS对合成的cRGD-siEGFR进行结构鉴定,高效液相色谱(HPLC)检测cRGD-siRNA分子的合成纯度。3. cRGD-siEGFR分子的血浆稳定性未经修饰siRNA、不同骨架修饰EGFR siRNA、以及合成的双链cRGD-siEGFR分子,与小鼠新鲜血浆1：1混合,在37℃条件孵育不同时间后,采用1.2%琼脂糖凝胶电泳测定其稳定性。4. cRGD-siEGFR分子体外生物学功能研究CCK-8法评价cRGD-siRNA分子的体外细胞毒性。共聚焦显微镜检测Cy5标记siRNA分子在细胞中的分布,以此验证cRGD-siEGFR分子的细胞靶向性。RT-qPCR和western blot评价cRGD-siEGFR分子在细胞水平抑制EGFR mRNA和EGFR蛋白表达的作用。流式细胞术定量检测U87 MG细胞对cRGD-siEGFR-cy5的摄取能力。CCK-8和EDU实验考察cRGD-siEGFR抑制U87MG细胞的增殖作用。流式细胞术测定cRGD-siEGFR诱导U87 MG细胞凋亡的作用。5. cRGD-siEGFR分子在体内的肿瘤靶向性及其代谢分布。成功建立肿瘤裸鼠模型后,尾静脉注射Cy5标记的cRGD-siEGFR (lnmol/20g)和EGFR siRNA (lnmol/20g)。分别在12h、24h、48h、72h进行活体成像。72h后颈椎脱臼法处死小鼠,迅速解剖取出肿瘤组织、心、肝、脾、肺、肾并进行荧光成像,观察各离体器官内siRNA的分布情况。激发波长和发射波长分别为640nm和680nm,6. cRGD-siEGFR分子的肿瘤组织靶向性。将实验动物随机分为3组,每组3只裸鼠,分别为U87 MG肿瘤模型cRGD-siEGFR组(A组)、U87 MG肿瘤模型裸siRNA组(B组)、Hela肿瘤模型cRGD-siEGFR组(C组)。当裸鼠肿瘤体积长到约150mm3时,开始给药,A组尾静脉注射Cy5标记的cRGD-siEGFR (1nmol/20g)、B组尾静脉注射Cy5标记的裸EGFR siRNA组(1nmol/20g)、C组尾静脉注射Cy5标记的cRGD-siEGFR (1nmol/20g),给药24h后水合氯醛(5%,120ul/20g)麻醉裸鼠取材处理,切片染色,显微镜观察cRGD-siEGFR在组织中的分布,评价cRGD-siEGFR分子的肿瘤组织靶向性。7. cRGD-siEGFR分子抗肿瘤生物学活性成功建立裸鼠肿瘤模型后,待裸鼠肿瘤体积长到约150mm3时,尾静脉注射给药。A组为正常对照组,给予生理盐水(125μl/20g)、B组cRGD-siNC组(5nmol/20g)、C组cRGD-siVegfr2(1.5 nmol/20g)、D组cRGD-siEGFR(1.5 nmol/20g)、E组为混合给药组cRGD-siVegfr2(1.5 nmol/20g)+cRGD-siEGFR (1.5 nmol/20g)、F组cRGD-siEGFR(5 nmol/20g)。每间隔48h给药一次,一共给药7次,在每次给药前和最后麻醉前测量荷瘤裸鼠体重和肿瘤体积,计算公式：V=ab2×0.5(a为长直径,b为短直径),最后一次给药3天后,水合氯醛(5%,120ul/20g)麻醉裸鼠取材,摘眼球法取血,分离血清；解剖分离肿瘤组织,液氮保存,分别用于qRT-PCR, Western Blot、TUNEL染色和免疫组化检测。8. cRGD-siEGFR分子的免疫原性和肝肾毒性考察采用Elisa测定以上各组裸鼠血清中IFN-α、IL-6、IFN-γ和IL-12的含量,以及谷丙转氨酶和肌酐含量,与正常对照组和阴性对照进行比较。进一步解剖摘取各组裸鼠心、肝、脾、肾进行病理切片,HE染色观察,与正常组进行比较。结果1. EGFR siRNA序列验证和骨架修饰经筛选验证,发现sense strand:5'-CAA AGU GUG UAA CGG A AUA dTdT-3'; antisense strand:5'-UAU UCC GUU ACA CAC UUUG dTdT -3' 的 EGFR siRNA序列具有较好的沉默效应,沉默EGFR mRNA的效率可达80%以上。确定了siRNA序列的骨架修饰方法,即在正义链和反义链的两端的三个碱基进行甲氧基修饰,可显著提高EGFR siRNA的稳定性,且不降低其沉默效率。2. cRGD-siEGFR分子的合成LC-MS鉴定结果表明,合成的cRGD-siEGFR分子质量与理论分子质量一致,证明合成成功。反相HPLC的纯度分析结果表明cRGD-siEGFR分子的纯度可达88.0%。3. cRGD-siEGFR分子的血浆稳定性实验结果表明,裸EGFR siRNA在血浆中稳定性较差,12h后大量降解,24h全部降解；第三种骨架修饰方式(即在正义链和反义链的两端的三个碱基进行甲氧基修饰)siRNA的稳定性最好,36h后仍有少量siRNA未被降解；cRGD-siRNA分子结构最稳定,到48小时仅有部分降解。4. cRGD-siEGFR分子体外生物学功能研究(1)CCK-8实验结果表明cRGD-siRNA分子细胞毒性非常小。当cRGD-siRNA给药浓度达到1500nM时,共培养24h后,细胞活性仍达到90.56%,浓度增大到2000nM时,细胞活性仍可达到82.92%。(2)共聚焦显微镜观察cRGD-siEGFR对U87 MG细胞的特异性靶向作用。cRGD-siEGFR可较好的将EGFR siRNA递送进入细胞内。而裸siRNA无法进入细胞内部,经RAD特异性封闭αvβ3受体后,cRGD-siEGFR也无法进入细胞内,表明cRGD-siEGFR可特异性的靶向高表达avβ3受体的肿瘤细胞,如U87 MG细胞系。(3) RT-qPCR实验结果表明,与control组的EGFR mRNA表达水平相比,转染浓度100nM和200nM时cRGD-siEGFR沉默效率较低,分别为2.55%和15.10%,与Control组相比不存在统计学差异(P=0.809和P=0.073)。与Control组相比,500nM、800nM、1000nM和lipo 2000/siRNA组的EGFR mRNA表达水平均显著下调,表达量分别为：47.39%、21.93%、13.34%和18.57%,且均有显著差异(P0.01)。从转染的剂量可以看出,随着浓度梯度的增大,cRGD-siEGFR分子的沉默效率逐渐增大,但达到1000nM时,其沉默效率超过了阳性对照lipo2000/siRNA组,且存在统计学差异(P=0.034)。(4) Western Blot实验结果表明,与control组的EGFR蛋白表达水平相比,裸siRNA组和cRGD-siNC组不存在统计学差异(P0.05)。cRGD-siEGFR和lipo 2000/siRNA的EGFR蛋白表达水平显著低于control组,分别为26.47%和15.04%(P0.01)。表明cRGD-siEGFR可有效沉默U87 MG细胞内EGFR蛋白表达。(5)流式细胞术实验结果表明,裸siRNA几乎不能进入U87 MG细胞内,Cy5阳性率仅为1.27%,荧光强度11.67,这与共聚焦显微镜的结果一致。与裸siRNA-Cy5组相比较,U87 MG对cRGD-siEGFR-cy5(100nM)、cRGD-siEGFR-cy5 (400nM)和lipo2000/siRNA-cy5的摄取能力较好,摄取阳性率分别为97.97%,98.68%和98.58%,平均荧光强度分别为347.00,1145.00和3133.67。且随着给药剂量增加,摄取量也相应增加,400nM的cRGD-siEGFR-cy5其摄取量是100nM剂量组的4倍,但相对于lipo2000/siRNA-cy5组,U87 MG对cRGD-siEGFR-cy5摄取量相对较低,只有lipo2000/siRNA-cy5组摄取量的35%。(6)CCK-8实验结果表明,不同浓度cRGD-siEGFR分子(400 nM、600nM、800 nM)在48h和72h均具有抑制U87 MG细胞增殖的作用,48h各浓度组细胞增殖活性依次为(77.11±10.19)%、(61.13±12.20)%、(44.52±7.35)%,72h各浓度组细胞增殖活性依次为(68.60±9.23)%、(52.11±8.21)%、(33.74±6.84)%,与Control组相比均具有统计学差异(P0.01)。EDU实验结果与CCK-8实验结果一致。(7)流式细胞术实验结果表明不同浓度的cRGD-siEGFR(400 nM、600 nM、 800 nM)均可不同程度的诱导U87 MG细胞产生凋亡,凋亡率分别为(26.59±5.87)%,(45.23±6.99)%和(53.88±7.38)%,与Control和阴性组相比,均具有统计学差异(P0.05)。5. cRGD-siRNA分子在体内的肿瘤靶向性及其代谢分布。裸鼠活体成像结果显示经小鼠尾静脉注射1nmol的cRGD-siEGFR分子(Cy5标记),cRGD-siEGFR分子可特异性靶向肿瘤部位。在12h、24h时肿瘤部位有大量Cy5荧光表达,在肾脏组织中也有较多的Cy5荧光表达,其次在肝脏中也有少量表达。而裸siRNA (Cy-5标记)在肿瘤部位12h、24h均未见Cy5荧光表达,在肾脏和肝脏有较高表达。解剖后,裸鼠的活体组织器官成像的结果和各解剖组织器官结果相一致,均显示cRGD-siEGFR分子可特异性靶向肿瘤组织。进一步延长时间观察结果显示,24h之后在肿瘤部位和肾脏的荧光表达逐渐降低,48h时肝脏基本无荧光表达,72h时肿瘤部位和肾脏的荧光表达量已经非常小；72h时裸siRNA (Cy-5标记)在肿瘤部位始终未见分布。解剖后,裸鼠的活体组织器官成像结果和解剖后各组织器官成像结果一致,表明cRGD-siEGFR的稳定性较好,48h时肿瘤部位仍有较高荧光表达,72h肿瘤部位仍有少量荧光表达,主要代谢部位为肾脏,其次为肝脏。6. cRGD-siRNA分子的肿瘤组织靶向性。尾静脉注射1 nmol裸siRNA和cRGD-siEGFR分子后,cRGD-siEGFR分子可通过肿瘤血管,渗入到肿瘤组织间质中,而裸siRNA无法进入肿瘤部位,在不表达αvβ3受体的正常组织和Hela肿瘤组织中,cRGD-siEGFR分子无法达到肿瘤部位,进一步在裸鼠体内证实cRGD-siEGFR分子可特异性靶向高表达αvβ3受体的肿瘤部位,并渗入肿瘤间质。7. cRGD-siRNA分子的抗肿瘤生物学活性尾静脉注射,连续给药7次,每间隔48h给药一次,每次注射前测量肿瘤体积和体重,最后一次给药3天后,再次测量肿瘤体积和体重,处死裸鼠,分离肿瘤,生理盐水洗净,滤纸吸干水分,拍照,称重。统计学分析各组荷瘤裸鼠肿瘤体积和瘤重变化情况,结果显示仅高剂量的cRGD-siEGFR (5nmol/20g)才能显著抑制肿瘤生长,低剂量的cRGD-siVegfr2(1.5 nmol/20g)和cRGD-siEGFR (1.5nmol/20g)具有抑制肿瘤生长的趋势,但无显著差异。RT-qPCR和Western Blot实验结果表明,cRGD-siEGFR (1.5nmol)组、cRGD-siVegfr2 (1.5nmol)+ cRGD-siEGFR (1.5nmol)联合给药组和cRGD-siEGFR (5nmol)组可明显降低肿瘤组织中EGFR mRNA和蛋白的表达水平,但cRGD-siEGFR (5nmol)作用最强,可到达约50%的体内沉默效率。Tunel染色结果表明,高剂量的cRGD-siEGFR (5nmol/20g)能明显诱导肿瘤细胞凋亡,低剂量的cRGD-siVegfr2 (1.5 nmol/20g)和cRGD-siEGFR (1.5nmol/20g)具有一定的诱导肿瘤细胞凋亡作用。8. cRGD-siEGFR分子的免疫原性和肝肾毒性考察Elisa和血生化实验结果表明,与对照组相比,cRGD-siRNA组细胞因子IFN-α, IFN-γ, IL-6和IL-12,肌酐和丙氨酸转氨酶均无统计学差异(P0.05)。表明cRGD-siEGFR免疫原性和毒性较小。病理切片结果进一步表明,cRGD-siRNA毒性小,即使高剂量(5nmol)连续给药7次后(间隔48h一次),对机体各脏器也未见明显毒性作用。结论通过将cRGD肽与小分子量PEG接头直接共价偶联到EGFR siRNA正义链末端,成功合成了cRGD-siEGFR分子,体外和体内的研究结果表明cRGD-siEGFR分子可特异性的靶向肿瘤部位,并进入肿瘤间质,特异性沉默EGFR mRNA的表达,并显著抑制肿瘤的生长,具有较好的临床研究前景。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R943;R96

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