miR-143在神经病理性疼痛的表观遗传调控及局部镇痛临床研究

发布时间：2018-04-25 15:38

本文选题：神经病理性疼痛 + 表观遗传　；参考：《第二军医大学》2016年博士论文

【摘要】：研究目的:神经病理性疼痛通常由神经组织的炎症或损伤造成,以痛觉过敏、异常痛敏和自发痛为主要特征[1]。神经病理性疼痛常表现为慢性疼痛、久治不愈,严重影响患者的生活质量。目前神经病理性疼痛的具体机制尚不明确,而常用的的治疗方法仍以阿片肽药为主,不仅副作用多,而且镇痛效果不理想,其发病率有逐年上升的趋势,因此神经病理性疼痛的治疗非常棘手,成为医学领域具有挑战性的研究课题。中枢神经元属于永久性细胞,其不可能通过凋亡和分裂来适应环境的变化,那么当机体周围环境或机体内环境发生变化时,为了适应新环境,神经元很可能通过表观遗传调控的适应性调节来稳定DNA或者调控神经元的变化[2]。当发生神经损伤时,很可能通过表观遗传调控基因的转录和翻译水平,影响蛋白质的表达量和功能,从而导致神经病理性疼痛的发生发展。同理,运用调控的手段干预表观遗传,也可以改变基因的转录、翻译水平,达到治疗神经病理性疼痛的目的[3]。表观遗传是指DNA序列不发生变化但基因表达却发生了可遗传的改变。表观遗传主要的调控手段有DNA碱基甲基化修饰、染色质重塑、组蛋白乙酰化修饰以及非编码RNA调控等方面[4]。因为表观遗传是可逆的,因此可以通过使用相应的分子生物学手段调控表观遗传,从而达到使基因沉默或者使沉默的基因重新再表达的目的。这种研究方向,已经成为治疗神经病理性疼痛的新思路和新方法[5]。DNA甲基化和非编码微小RNA(microRNA,mi RNA)的调控是最早发现又普遍存在的基因表达的表观遗传调控方式[6]。DNA的甲基化是在碱基的序列不发生变化的情况下,在胞嘧啶第5位的碳原子上添加甲基,甲基化如果发生在启动子或其他区域能关闭相关基因的活性。miRNA是一类长度约为19-25个核苷酸的内源性非编码RNA。miRNA和RISC(RNA-induced silencing complex)形成复合体后与靶标mRNA的3’端非编码区发生不完全结合,阻止mRNA的翻译,广泛参与基因转录后调控活动。研究表明miRNA参与生物体的发育,细胞的分化、增殖、凋亡等各种各样的调节途径,具有重要的基因表达调控作用[7]。课题组前期研究已证实在表观遗传学的机制中DNA甲基化酶催化的甲基化能参与神经病理性疼痛的发生发展,尤其DNA甲基化转移酶3a(DNA methylation transferase 3a,DNMT3a)在神经病理性疼痛的发生发展过程中起关键作用,而miRNA通过对甲基化转移酶DNMT3a的转录后调控镇痛的相关研究在国内外尚属空白。本课题利用选择性结扎并切断L5脊神经(spinal nerve ligation,SNL)神经病理性疼痛大鼠模型,结合体外原代背根神经节细胞培养证实了miRNA-143(miR-143)可以通过转录后调控dnmt3a的蛋白表达,从而下调μ阿片肽受体(μopioidpeptidereceptor,mor)蛋白表达,参与神经损伤疼痛的发生发展,为神经病理性疼痛的治疗提供新的思路和理论依据。本课题最后在临床诊疗过程中,采用前瞻性随机试验,观察罗哌卡因伤口局部持续输注用于胸腰椎手术后的镇痛效果以及对慢性疼痛发生率的影响。研究方法:1.检测神经病理性疼痛模型mir-143的变化:雄性sprague-dawley(sd)成年大鼠随机分为假手术组(sham组)和snl组。snl组大鼠麻醉后暴露l5脊神经,结扎并切断;sham组大鼠麻醉后只暴露l5脊神经。分别于术后第3、7天再次测定各组大鼠的机械痛阈、热痛敏和冷痛敏后,麻醉下处死,取双侧脊神经节逆转录定量聚合酶链反应(reversetranscriptionquantitativepolymerasechainreaction,qrt-pcr)测定其mir-143的表达。2.检测在体过表达mimics-mir-143对神经病理痛的影响:麻醉状态下暴露脊神经节,采用脊神经节显微注射的方法微量注射mir-143mimics,观察mir-143对大鼠神经病理性疼痛的干预。将大鼠随机分为5组:na?ve组、veh+snl组(l5神经节显微注射生理盐水2.0μl)、mir-143+snl组(l5神经节显微注射mir-1432.0μl),mir-143+sham组(l5神经节显微注射mir-1432.0μl),negativecontrol(nc)+snl(l5神经节显微注射ncmirna2.0μl)各组均为显微注射后3天行snl手术或sham手术(仅仅暴露脊神经)。术后3、5、7天检测大鼠的机械痛阈、热痛敏和冷痛敏。3.检测在体神经节抑制mir-143的表达对大鼠疼痛行为的影响:麻醉状态下暴露脊神经节,采用脊神经节显微注射的方法微量注射inhibitor-mir-143,观察下调mir-143对大鼠神经病理性疼痛的影响。实验分为三组vehicle组(暴露l4和l5的drg分别显微注射2.0μl的生理盐水),mir-143inhibitor组(暴露l4和l5的drg分别显微注射2.0μl的mir-143inhibitor),inhibitorcontrol组(暴露l4和l5的drg分别显微注射2.0μl的mir-143negativeinhibitor)。注射后3、5天检测大鼠的机械痛阈、热痛敏和冷痛敏。4.体外检测mir-143的作用机制:原代培养3周大小的sd大鼠脊神经节细胞,转染mimicsmir-143。转染2天后收集细胞分别提取rna和蛋白质,通过rt-pcr或western-blot的方法检测其下游目的基因dnmt3a的信使rna(messagerna,mrna)及蛋白变化。5.检测在体过表达mimics-mir-143对神经病理痛干涉的机制:麻醉状态下暴露脊神经节,采用脊神经节显微注射的方法微量注射mimics-mir-143,观察mir-143高表达后对下游蛋白dnmt3a的影响。将大鼠随机分为5组:na?ve组、veh+snl组(l5神经节显微注射生理盐水2.0μl)、mir-143+snl组(l5神经节显微注射mir-1432.0μl)、mir-143+sham组(l5神经节显微注射mir-1432.0μl)、nc+snl(l5神经节显微注射ncmirna2.0μl)各组均为显微注射后3天行snl手术或sham手术(仅仅暴露脊神经并未结扎)。snl术后5天取大鼠的l5神经节做qrt-pcr检测mir-143下游基因dnmt3a及其下游基因mor的mrna的表达,snl术后7天取大鼠的l5神经节做western-blot检测mirna-143下游基因dnmt3a及dnmt3a的下游基因mor的蛋白表达变化。6.检测在体神经节抑制mirna-143的表达对下游dnmt3a及dnmt3a的下游mor的mrna及蛋白的变化:麻醉状态下暴露脊神经节,采用脊神经节显微注射的方法微量注射inhibitormirna-143。实验分为三组vehicle组(暴露l4及l5的drg显微注射2.0μl的生理盐水),mir-143inhibitor组(暴露l4及l5的drg显微注射2.0μl的mir-143inhibitor),inhibitorcontrol组(暴露l4及l5的drg显微注射2.0μl的mir-143negativeinhibitor)。注射后5天麻醉状态下取大鼠l4及l5的drg检测其下游基因dnmt3a及dnmt3a的下游基因mor的mrna及蛋白的变化。7.伤口输注局麻药对慢性疼痛发生率的影响研究:择期行后路胸腰椎手术患者71例,随机分为两组:局麻药组采用局部镇痛泵经伤口持续输注0.33%罗哌卡因,静脉组使用静脉镇痛泵输注氟比洛芬酯、喷他佐辛、帕洛诺司琼。在术后2、4、6、12、24、36和48小时,评价术后疼痛程度及不良反应的发生率,并于术后3个月随访调查慢性疼痛发生率。研究结果:1.snl组大鼠术后第3、7天测定各组大鼠的机械痛阈、热痛敏和冷痛敏显示与sham组相比,snl组术侧足机械痛阈值、热痛敏和冷痛敏值较sham组明显下降,差异有统计学意义(p0.05)。术后3、7天qrt-pcr测定其mir-143的表达。与sham组相比,snl组术侧l5drg的mir-143显著下降,差异有统计学意义(p0.05)。2.在体过表达mimics-mir-143对神经病理痛的影响:与na?ve组相比,mir-143+sham组、mir-143+snl组qrt-pcr结果显示mir-143高表达成功,增高明显,有统计学意义(p0.05)。行为学检测结果显示与na?ve组相比,veh+snl组、nc+snl组机械痛阈值、热痛敏值和冷痛敏值均明显下降,差异有统计学意义(p0.05)。与veh+snl组、nc+snl组相比,mir-143+snl组机械痛阈值、热痛敏值和冷痛敏值均明显提高,差异有统计学意义(p0.05)。3.qrt-pcr显示inhibitormir-143可以下调大鼠l4、l5drg内mir-143的表达量,与vehicle组、inhibitornc组相比,inhibitormir-143组术侧机械痛阈值、热痛敏值和冷痛敏值均下降,下降有统计学意义(p0.05)。4.原代培养SD大鼠的脊神经节细胞,转染mimics miR-143后,Western-blot显示DNMT3a蛋白表达明显减少的同时MOR的蛋白表达上升,二者差别均有统计学意义(P0.05)。与Western-blot相比,qRT-PCR的结果显示DNMT3a的mRNA并无明显变化(P0.05),但DNMT3a的下游MOR的mRNA表达上升,差别有统计学意义(P0.05)。5.在体过表达mimics-miR-143显示:与Na?ve组相比,Veh+SNL组、NC+SNL组和mi R-143+SNL组DNMT3a的mRNA均明显升高(P0.05),Veh+SNL组和NC+SNL组MOR的mRNA均明显下降(P0.05),同时Veh+SNL组和NC+SNL组DNMT3a蛋白表达明显增加的同时MOR的蛋白表达下降,差异有统计学意义(P0.05)。与Veh+SNL组、NC+SNL组相比,miR-143+SNL组DNMT3a蛋白表达明显下降的同时MOR的蛋白表达上调,差异有统计学意义(P0.05)。6.在体神经节显微注射miR-143 inhibitor后显示:与Vehicle组、inhibitor NC组相比,miR-143 inhibitor组DNMT3a的mRNA变化无统计学差异(P0.05)、蛋白表达增加(P0.05),MOR的mRNA及蛋白表达均下降,差异有统计学意义(P0.05)。7.术后48h内两组患者疼痛评分差异无统计学意义。局部镇痛组慢性疼痛发生率明显低于静脉组(P0.05)。研究结论:1.在慢性神经性病理疼痛中,表观遗传起重要作用,其中miR-143的减少、DNMT3a的增加都参与到神经病理性疼痛的发生发展。2.miR-143通过DNMT3a的转录后调控影响DNMT3a的蛋白表达量,DNMT3a通过MOR的启动子甲基化程度的改变而影响疼痛的发生发展。3.外源性mi R-143可以通过下调DNMT3a的蛋白水平,减少MOR的甲基化,增加MOR的表达,从而治疗疼痛,或许可以成为治疗疼痛的新的药物。4.局部镇痛泵系统应用于胸腰椎术后镇痛效果与静脉镇痛系统相似,但能明显降低慢性疼痛的发生率。
[Abstract]:Objective : neuropathic pain is usually caused by inflammation or injury of nerve tissue . It is characterized by hypersensitivity , allodynia and spontaneous pain . Neuropathy rational pain is often manifested as chronic pain , the cure is not the more serious , the quality of life of the patient is seriously affected . The current treatment method is not clear , but the common treatment method is still not ideal , the incidence of neuropathic pain is not ideal , the incidence of neuropathic pain is very difficult , it is a challenging research topic in the medical field . In order to adapt to the new environment , the neuron is likely to stabilize the DNA or regulate the change of neurons by the adaptive regulation of apparent genetic regulation . When nerve injury occurs , it is very likely that the expression amount and function of protein can be influenced by the transcription and translation level of the epigenetically controlled gene , which can lead to the development of neuropathic pain . Similarly , using the means of regulating and regulating the apparent inheritance can also change the transcription and translation level of the gene , so as to achieve the purpose of treating neuropathic pain . The apparent inheritance is that the DNA sequence does not change , but the gene expression has been genetically altered . The main control methods of apparent inheritance include DNA base methylation modification , chromatin remodeling , histone acetylation modification , and non - coding RNA regulation . Since the apparent inheritance is reversible , it is possible to regulate the apparent inheritance by using the corresponding molecular biological means so as to achieve the purpose of silencing the gene or re - expression of the silenced gene . DNA methylation and non - coding microRNAs ( microRNA , mi RNA ) are the earliest and ubiquitous expression of gene expression . miRNA is a class of endogenous non - coding RNAs with a length of about 19 - 25 nucleotides . miRNA is a class of endogenous non - coding RNAs with a length of about 19 - 25 nucleotides . miRNA and RISC ( RNA - induced complex complex ) form a complex . In this study , we investigated the effects of local continuous infusion on the neuropathic pain in rats . The effect of local continuous infusion on neuropathic pain in rats was investigated . The decrease of miR - 143 and the increase of DNMT3a participate in the development of neuropathic pain .

【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R402

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