形寒寒饮伤肺理论及致病机制的实验研究

发布时间：2018-04-28 13:30

本文选题：外寒 + 寒饮　；参考：《湖北中医药大学》2014年博士论文

【摘要】：目的 “形寒伤肺”与“寒饮伤肺”是中医学重要的病因病机理论。形寒与寒饮皆为从外感受的寒邪，不论是单方面的致病因素“寒饮”或“形寒”，还是两个致病因素叠加的“形寒寒饮”，均易伤肺致病，为导致咳病的主要病因。近年来，学术界对《内经》“形寒寒饮则伤肺”有较多的临床病证报导，但关于形寒与寒饮致病的实验研究，尤其是两者的比较研究则较少见。为此，本课题拟在中医学病因病机理论指导下，模拟温度、时间等作用因素，将小鼠分别置于寒冷环境、灌饲冷水，以制备“形寒”、“寒饮”的动物模型。并以肺脏作为研究的靶器官，将各组研究数据进行比较，观察形寒、寒饮及形寒寒饮叠加对小鼠肺脏主气司呼吸、主行水、朝百脉及卫外等机能的影响。并且通过检测呼吸道黏多糖、粘膜免疫分子IgG、SIgA、TNF-α、黏蛋白MUC5AC及肺部AQP-4和全血粘度、血浆粘度等指标，以“形寒”与“寒饮”的对比为切入点，探索《内经》“形寒寒饮则伤肺”的理论内涵和现代病理机制，为指导临床实践提供实验依据。本课题具有一定的理论创新和临床指导价值。方法 1.理论研究寒为冬季的主气，是六气之一，是大自然正常的气候变化。但若气候变化异常，寒气过长时间作用于人体，则伤人正气，致人疾病，此时的寒气则称为寒邪。寒邪致病也可见于其他季节，如气温骤降、涉水淋雨、汗出当风以及夏季空调过凉或过食生冷等亦感受寒邪的重要因素。寒邪致病有伤寒、中寒的不同，“伤寒”即寒邪伤及肌表，郁遏卫阳，阳气抗邪于外所表现的表寒证，为“形寒”因素致病的病证。“中寒”即寒邪直中于里，伤及脏腑阳气，阻滞脏腑气机和血液运行所表现的里寒证，为“寒饮”因素所致的病证。肺为娇脏，主气司呼吸，主行水，朝百脉，主治节，具有宣发肃降的生理特性。肺通过宣发和肃降的协调作用，使气道通畅，呼吸调匀，体内外气体得以正常交换，同时对体内水液的代谢也起着疏通和调节的作用。再者，肺通过宣发卫气于体表，使卫气能够调节控制腠理的开阖，汗液有节制地排泄，从而实现卫外御邪的功能。肺主气，司呼吸，开窍于鼻，又外合皮毛，内为五脏华盖，不耐寒热，是为娇脏。“形寒”与“寒饮”皆属寒邪，最易伤人阳气，故机体感受寒邪常首先犯肺。寒邪可通过皮毛、口鼻等器官侵入肺脏，使肺脏受损。除《内经》有“形寒寒饮则伤肺”的论述外，《难经·四十九难》也有“形寒饮冷则伤肺”之言，说明外感寒邪和冷食冷饮皆可伤肺。《素问·咳论》“其寒饮食入胃，从肺脉上至于肺则肺寒”之语，则明确指出了寒饮入胃进而伤及肺脏的病理机制。《灵枢·百病始生》则强调了形寒和寒饮叠加致病伤肺，故有“重寒伤肺”之言。这里所谓的“重寒”，即指形寒、寒饮两个致病因素叠加伤肺致病的情况。形寒与寒饮皆为寒邪，易伤阳气，但会因不同的致病因素导致肺脏的生理机能失常而产生不同的临床表现。肺受寒邪的主要途径，一个是与皮毛有关，因肺在体合于毛，皮毛受寒而表现为外感风寒伤肺的表实证；另一个是与肺胃经脉相关，因寒饮从口入胃，从肺脉上至于肺，从而出现肺胃阳虚阴盛的虚寒证。“形寒”伤肺，多易导致肺失宣发的病证。伤肺首先伤及肌表，肺气失宣，使肺行水功能障碍，卫阳被遏制，从而出现腠理闭塞而恶寒无汗；津液内停聚而为饮，呼吸不畅故见胸闷喘咳。治疗上则以发散风寒，宣肺平喘为主。“寒饮”伤肺多易导致肺失宣发所致的病证，主要表现为阴盛阳虚的病理机制。肺阳受损，肺气不足则宣降无权，气化失常，导致肺行水功能失常形成痰饮。而痰饮易阻塞气道，影响气体交换出现咳喘痰多，甚至不能平卧。治疗上应从肺胃入手，温肺化饮，当以温药和之。临床上对于支气管哮喘、慢性阻塞性肺气肿、肺间质疾病、慢性咳嗽等属于寒饮伤肺的患者，皆可用此法治疗。从肺受寒的程度上进行比较，寒饮兼有外感寒邪（即形寒寒饮）相对于单一的因素形寒或寒饮伤肺而言，形寒寒饮伤肺的程度更深。肺气失于宣降，肺胃阳气受损，则肺主治节的生理机能及宗气的生成、运行均可受到影响。宗气生成不足，气机不畅，推动血运无力，气血运行不畅，则出现胸膈满闷、呼吸不利，血液及水液潴留诸症，治疗上应以宣肺散寒、温肺化饮为主。 2.实验研究 2．1实验方法 2.1.1实验动物及分组 SPF级昆明种小鼠40只，体重(17±1)g，常规饲养10天后随机分为4组：①常温对照组，②形寒组，③寒饮组，④形寒寒饮组。各组均在15天后麻醉、断颈处死动物后，取标本置-80℃冰箱备用 2.1.2造模过程及实验方法 ①常温对照组：动物在处于风力0级，温度在20±2℃，相对湿度50%～60%的环境中适应性饲养1周，自由饮水饮食。 ②形寒组：动物处于风力0级，每天下午2:00～4:00将动物置于温度4℃、湿度50～60%的人工气候箱中饲养2小时，取出后按照常温饲养。期间观察小鼠的整体情况，记录出现异常的具体行为。施加造模后测量体重的变化，与其他组的小鼠体重进行比较，观察并记录体重的差异。造模连续15天。 ③寒饮组：动物处于风力0级，每日于上午8：00，中午12：00和下午6:00给予4℃冷水（按要求给水灌胃量0.1ml/10g）灌胃。期间观察小鼠整体情况，记录异常行为。施加造模后测量体重，并与形寒组、常规对照组的体重进行比较，观察不同组之间体重的差异。造模持续15天。 ④形寒寒饮组：动物处于风力0级，每日于上午8：00，中午12：00和下午6:00给予4℃冷水（按要求给水灌胃量0.1ml/10g）给小鼠灌胃，然后于每日下午2:00～4:00将动物置于温度4℃、湿度50～60%的人工气候箱中饲养2小时。期间观察小鼠整体情况，记录出现异常的具体行为。施加造模后测量小鼠的体重，与其他组进行比较，观察体重的差异。造模连续15天。 2.2指标检测 2.2.1一般观察项目观察小鼠的神态、活动情况、饮食饮水量、口唇耳色泽，皮毛情况以及体重、肛温等情况。 2.2.2小鼠肺组织结构观察采用苏木素伊红（HE)染色法，光镜观察。 2.2.3肺组织AQP-4表达采用Western blot法检测。 2.2.4气道黏多糖的检测采用咔唑比色法检测。 2.2.5呼吸道粘膜免疫分子IgG、SIgA、TNF-α的检测采用ELISA试剂盒检测。 2.2.6呼吸道黏蛋白MUC5AC检测采用实时定量荧光PCR检测。 2.2.7血液流变学的检测采用肝素抗凝管常规取小鼠眼球血约1.2ml，经仪器自动检测全血粘度(高切、中切和低切），每份样本重复检测3次，仪器自动记录结果，取均值。 2.3统计学处理应用SPSS16.0软件进行统计学处理。符合正态分布的计量资料以均数±标准差(x s)表示，采用单因素方差分析,组间两两比较采用q检验、t检验、卡方检验。P0.05为差异有统计学意义。结果 ⑴一般情况常温对照组在第1天到第15天内小鼠口唇红润，毛发有光泽，耳朵、尾巴呈淡粉色，食量正常，体重逐渐增加，呼吸平稳，反应灵敏，肛温正常，便质正常；形寒组、寒饮组、形寒寒饮组小鼠口唇、耳朵、尾巴由粉色逐渐变苍白，呼吸由先快，后逐渐减慢，饮食量逐渐减少，大便质地偏软、湿烂。肛温逐渐下降，体重逐渐下降。形寒组小鼠在第1天到第7天，体重逐渐加重，呼吸加快，活动非常活跃，竖毛反应，拱背蜷缩，扎堆，寒颤，口唇欠红润，毛发欠光泽；寒饮组还表现出精神萎靡，反应迟钝，饮食量逐渐减少，大便溏。形寒寒饮组小鼠口唇、耳朵及尾部欠红润，体重逐渐由先增加，后逐渐减轻，呼吸加快，肛温及体温均逐渐下降，大便偏软。在第8天到15天，常温对照组小鼠皮色、饮食、活动、二便、呼吸、体重及肛温均正常。形寒组小鼠出现精神萎靡不振，蜷缩少动，呼吸逐渐减慢，饮食量逐渐减少，口唇、耳廓及尾巴皮色逐渐变苍白，体重逐渐减轻，肛温逐渐恢复正常。寒饮组、形寒寒饮组小鼠开始出现扎堆，舌色明显为紫暗，耳廓、尾巴皮色呈暗红，反应迟钝；呼吸逐渐减慢，饮食量逐渐减少，肛温及体重逐渐下降。形寒寒饮组第15天呼吸更微弱，静卧不动，甚至拒食，消瘦明显，皮毛无光泽，口唇、耳朵的颜色为苍白。肛温、体重与形寒组、寒饮组比较数值最低，大便质地软、湿烂等症状较第7天重。 ⑵各组体重检测结果在造模第7天至第15天内，常温对照组小鼠体重随着时间的延长，体重数值呈逐渐增加趋势。形寒组、寒饮组和形寒寒饮组体重随着时间的延长，体重数值呈逐渐降低。与常温对照组相比，形寒组、寒饮组和形寒寒饮组小鼠在7天内的体重均偏高，组间体重比较，形寒组体重增高最明显，寒饮组次之，形寒寒饮组再次之；形寒、寒饮组在第15天内的体重均高于常温对照组，形寒寒饮组小鼠体重数值低于常温对照组，组间体重比较，形寒寒饮组体重减轻最明显，形寒组体重高于寒饮组。 ⑶各组肛温检测结果随着造模时间的延长，常温对照组、形寒组、寒饮组、形寒寒饮组小鼠在第7天的肛温均低于第15天。在造模第7天，，与常温对照组比较，形寒组、寒饮组、形寒寒饮组均降低。组间比较，形寒寒饮组小鼠肛温降低最明显，寒饮组次之，形寒组再次之；在造模第15天，与常温对照组比较，形寒组小鼠肛温偏高，寒饮组与形寒寒饮组均降低，组间比较，形寒寒饮组小鼠降低最明显，寒饮组次之，形寒组再次之。 ⑷病理结果光镜下肺组织的病理切片显示，常温对照组、寒饮组、形寒组、形寒寒饮组肺部病变程度按照此顺序排列呈递增趋势，以形寒寒饮组最为明显，形寒组次之、寒饮组再次之。①常温对照组：肺组织、支气管、肺泡结构清晰，支气管上皮完整，中、小支气管粘膜上皮细胞排列整齐，肺间质无炎性细胞浸润，肺泡壁未见增生，肺泡间隔未见充血水肿，肺泡腔无扩大，并且没有液体渗出。②形寒组：支气管粘膜层和粘膜下层有轻至中度炎细胞浸润，外膜层内有部分炎细胞浸润，间质有大量的炎细胞浸润、充血、水肿。③寒饮组：支气管粘膜下层及外膜层均见到轻至中度炎细胞浸润，伴轻度间质炎细胞浸润，还有部分的肺组织坏死。④形寒寒饮组：支气管粘膜下层见部分炎细胞浸润，肺间隔内有淋巴细胞构成的淋巴结样结构，部分还可见到大量中性粒细胞构成脓肿样结构。 ⑸肺组织AQP-4表达的检测结果 Western blot法检测形寒组、寒饮组与形寒寒饮组小鼠肺组织AQP4蛋白表达，结果均显著低于常温对照组；与寒饮组比较，形寒组及形寒寒饮组肺组织AQP4蛋白表达下降，以形寒寒饮组下降明显，形寒组次之；与形寒组比较，寒饮组肺组织AQP4蛋白表达偏高，形寒寒饮组肺组织AQP4蛋白表达降低。提示形寒与寒饮可能通过下调AQP4的表达影响肺主通调水道的功能，从而加重肺泡和间质水肿，以形寒与寒饮两种致病因素相合的作用最明显，形寒次之，寒饮再次之。 ⑹气道黏多糖的检测结果用咔唑比色法检测各造模组小鼠气道D-葡萄糖醛内酯数值的变化。根据气道的病理组织学结果，显示形寒组小鼠的支气管粘膜层、粘膜下层和外膜内见到较多的炎细胞浸润，寒饮组支气管粘膜偶见炎细胞浸润，形寒寒饮组能够见到支气管粘膜下层见到部分的炎细胞浸润。再结合本实验气道D-葡萄糖醛内酯数值结果显示形寒组、寒饮组、形寒寒饮组与常温对照组比较，数值均升高。与形寒组比较，形寒寒饮组比值偏高，寒饮组偏低。与寒饮组比较，形寒寒饮与形寒组比值也升高，以形寒寒饮组最明显。以上结果证实，形寒寒饮的确能够使气道分泌物增多，导致小鼠气道组织病变，其病变程度以形寒寒饮两者相合最明显，形寒次之，寒饮再次之。 ⑺呼吸道粘膜免疫分子的检测结果采用ELISA试剂盒检测各组小鼠支气管肺泡灌洗液中气道液IgG数值。结果显示与常温对照组比较，形寒组、寒饮组与形寒寒饮组气道液IgG表达值均明显升高。与寒饮组比较，形寒组与形寒寒饮组表达值升高，以形寒寒饮组表达值升高最明显，形寒次之；与形寒组比较，形寒寒饮组比值升高，寒饮组表达值偏低，提示形寒与寒饮均能能够使血清中产生大量的IgG,肺脏不易受到外邪的侵犯，与中医肺主卫外的功能相符，以形寒与寒饮两者相合的作用更明显，形寒次之，寒饮再次之。气道液TNF-α的含量结果显示：与常温对照组相比，各造模组的TNF-α的浓度均明显升高；与寒饮组比较，形寒组与形寒寒饮组均升高，以形寒寒饮组升高最明显；与形寒组比较，形寒寒饮组比值升高，寒饮组比值偏低，提示形寒与寒饮皆能诱发肺部感染，其程度以形寒寒饮最明显，形寒次之，寒饮再次之气道液SIgA的含量结果显示：与常温对照组比较，形寒组，寒饮组及形寒寒饮组气道液中SIgA表达值均明显降低；与寒饮组比较，形寒组与形寒寒饮组的表达值均降低，以形寒寒饮最明显；与形寒组比较，寒饮组表达值升高，形寒寒饮组表达值下降，提示形寒与寒饮均可使呼吸道粘膜免疫分子SIgA表达减少，引起呼吸道感染，甚至发展为肺炎乃至全身感染，以形寒与寒饮两者致病因素相合对肺脏的损伤更严重。从气道粘膜分泌的程度上比较，寒饮能促使气道液产生大量的SIgA，使气管发生病变，亦能使肺脏受到损伤，“肺主行水”功能受到影响，即津液生成及代谢功能障碍而停聚形成痰饮。（8）呼吸道黏蛋白MUC5AC检测结果采用实时定量荧光PCR检测各组小鼠呼吸道MUC5AC数值的变化。结果显示，与常温对照组比较，形寒组、寒饮组、形寒寒饮组气道黏液蛋白的表达均明显升高；与寒饮组比较，形寒组与形寒寒饮组表达值均升高，以形寒寒饮组升高明显；与形寒组比较，形寒寒饮组气道黏液蛋白的表达值偏高，寒饮组低于形寒组，提示形寒与寒饮均能使黏蛋白MUC5AC在气道和肺组织中高度表达，引起许多严重的呼吸道疾病和损害肺功能，其损伤的程度以形寒与寒饮两者相合作用最明显，形寒次之，寒饮再次之 (9)血液流变学检测结果血液流变学检测结果显示，与常温对照组比较，各组全血粘度数值均偏高；与形寒组比较，形寒寒饮组全血低切的粘度（10s-1）偏高，以形寒寒饮组全血低切粘度增高最明显；与寒饮组比较，形寒组和形寒寒饮的全血低切黏度（10s-1）均偏高，以形寒寒饮组全低切黏度偏高最明显，为了检测反映红细胞的聚集情况，选择在低切变率的情况下检测血液流变学各组数值的变化，结果提示形寒与寒饮均能使血液粘稠度升高，进一步使机体微循环障碍和促使血栓形成，造成血瘀，从中医角度来描述影响肺朝百脉的功能，符合寒凝瘀血的致病特征，其损伤程度以形寒寒饮两者相合最明显，形寒次之，寒饮再次之。结论综合上述结果，可发现形寒与寒饮在刺激小鼠处理7天后，各造模组的肛温数值均降低，体重逐渐偏高，随着寒邪持续时间的延长，各造模组小鼠在处理15天后肛温数值均偏高，体重逐渐减轻，小鼠口唇、耳廓、皮肤的色泽由粉红转变为苍白；小鼠蜷缩在一起，扎堆，寒战明显，静卧不动，呼吸由较快逐渐变微弱，体重逐渐减轻。以上症状说明形寒和寒饮均能促使机体表现一系列受寒的征象，其程度以形寒和寒饮两者致病因素相互叠加对机体的影响最为严重，寒饮次之，形寒再次之。根据各造模组肺组织病理切片的结果提示形寒与寒饮皆能伤肺，且肺部病变的程度以形寒寒饮两者致病因素相叠加最为严重，寒饮次之，形寒再次之，说明各造模组造模是成功的。通过呼吸道黏多糖、黏膜免疫分子可发现单因素的“形寒”、“寒饮”和两者致病因素相叠加的“形寒寒饮”等外邪能损伤肺脏，均能成为诱发肺部感染的致病因素，均能严重影响D-葡萄糖醛内酯（MS）及多种炎性细胞因子IgG,SIgA和TNF-α的表达，使机体免疫防疫作用降低，导致肺部感染加重乃至全身感染，肺部感染的程度以形寒寒饮最为严重，形寒次之，寒饮再次之；通过观察肺组织AQP4蛋白表达可发现形寒与寒饮均能严重影响气道及肺组织AQP4的表达，加重气道炎症，影响肺的通调水道的功能，从而进一步影响肺的呼吸功能，病变程度以形寒寒饮最明显，形寒次之，寒饮再次之。对不同的各造模组进行血液流变学的检测，根据结果提示形寒寒饮两者相合可使小鼠血液粘度增加，全身血流阻力增大，容易形成微循环障碍和血栓，加重呼吸功能的减退和低氧，此结果符合“寒性凝滞”的性质和致病特征，其致病程度以形寒寒饮两种致病因素相叠加最明显、形寒组次之、寒饮组再次之。总之，形寒与寒饮等外邪均能对肺脏引起损伤并影响病情程度；形寒与寒饮等外邪均能促进多种炎症细胞因子的表达及影响气道黏多糖分泌的障碍，使机体免疫防御功能减退，导致易受外邪的侵袭而发病，病情程度以形寒与寒饮两者致病因素相互叠加最为严重，形寒次之，寒饮再次之。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：湖北中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R221

【参考文献】