2型糖尿病大鼠模型的中医证候演变及中药干预的方证相关性研究

发布时间：2018-05-05 22:52

本文选题：病证模型 + 2型糖尿病　；参考：《北京中医药大学》2015年博士论文

【摘要】：“方证相关”不仅是中医方剂学中的一个重要命题,也是辨证论治原理的逻辑基础,近年来已成为中医药研究领域的热点和重点。目前围绕“方证相关”的研究基本上还是在证的静态或空间分布的角度上对方证关系进行探讨,基于中医证候演变特性,对以病为背景的中医证候进行动态干预的方证关系的评价尚未有见。之前,本学科在参考国外研究的基础上,采用高脂高糖喂饲5周后一次性腹腔注射小剂量链脲菌素(STZ)成功诱导出大鼠T2DM模型,观察到该模型发展中表现出中医不同证候类型,即以IR为病理背景,以气阴两虚为基本病机,先后出现气阴两虚、气阴两虚兼痰浊、气阴两虚兼痰瘀的病机演变趋势,提示该模型可能是T2DM病理发展中中医证候随时相变化的一个非常有用的病证结合模型。本课题基于T2DM的现代研究背景知识、中医证候的某些现代内涵及中医防治糖尿病的有效方药,从系统生物学角度,采用整体多系统指标,在探讨该模型阶段性病理生理演变规律与中医证候关联的基础上进一步考查相关方药对模型不同时相证候的干预效应,探讨基于T2DM病理背景的中医证候演变的现代内涵和方证关联的生物学基础及有效干预方药的作用机制。本文分为文献综述和实验研究两大部分。文献综述主要包括2型糖尿病发病及机制的研究进展；2型糖尿病大鼠模型中医证候分型及其与现代病生理关系的研究两方面。实验研究主要包括2型糖尿病大鼠模型不同时相的中医证候演变；基于数据分析对2型糖尿病演变中不同时相的中医证候内涵表征的探讨；2型糖尿病大鼠模型不同时相动态干预的方药效应比较三个部分。研究一2型糖尿病大鼠模型不同时相的中医证候演变方法：健康雄性SD大鼠150只,随机分为正常组75只和造模组75只。其中正常组给予基础饲料喂养,造模大鼠给予高脂高糖饲料,连续5w。第6w,造模组给予一次性腹腔注射STZ溶液。之后第三天,尾静脉采血检测大鼠空腹血糖,选择FPG≥11.1mmol/L的大鼠正式纳入模型组。分别从正常组和模型组中随机挑选12只大鼠,麻醉经腹主动脉采血,待测相关指标：血清胰岛素(Fins)、血清胰岛素降解酶(IDE)、血清胰高血糖素(GC)、血清生长抑素(SS)、一氧化氮合酶(iNOS)、瘦素(Leptin)、C反应蛋白(CRP)、总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、同型半胱氨酸(Hcy)、肾素(Renin)、视黄醇结合蛋白(RPB4)、血浆环磷酸腺苷/环磷酸鸟苷(cAMP/cGMP)、超氧化物歧化酶(SOD)、游离脂肪酸(FFA)、载脂蛋白(Apo-A)、纤维蛋白原(FIB)、血浆血栓素(TXB2)、血浆6-酮-前列环素Flα(6-keto-PGF1α)以及红细胞膜钠-钾-ATP酶(Na+-K+-ATPASE);迅速分离相关脏器组织检测相关指标：肌肉胰岛素受体数量(Ins R)、肌肉葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)、肝脏胰岛素受体数量(Ins R)、肝脏葡萄糖转运蛋白2(GLUT2)、脂肪胰岛素受体数量(Ins R)、脂肪葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)。模型继续高脂喂养,于第8w、第10w和第12w禁食8小时后分别从正常组、模型组各取12只大鼠,腹腔麻醉,经腹主动脉采血,待测Fins、糖化血红蛋白(HbAlc)、IDE、GC、SS、iNOS、Leptin、CRP、NF-κB、 TC、TG、HDL-C、LDL-C、Hcy、Renin、RPB4、抵抗素(Resistin)、肌肉素(Musclin)、胰淀素(Amylin)、皮质醇(CORT)、促肾上腺皮质激素(ACTH),血浆cAMP/cGMP、 SOD、FFA、Apo-A、FIB、TXB2、6-keto-PGF1α以及Na+-K+-ATPase,迅速分离相关脏器组织检测相关指标：肌肉Ins R与GLUT4、肝脏Ins R与GLUT2、脂肪Ins R与GLUT4。每周观测并记录造模中各组大鼠的毛发色泽、行为状态、舌、尾、体重、抓握力、血压、饮食、饮水、大便及小便量等外观行为方面的变化。结果：(1)T2DM外观表征指标变化：与正常组相比,模型组大鼠体重、抓握力在10-12w时显著性降低(P0.01),血压在5w+3d-12w显著性升高；大鼠饮食量、饮水量、大便量、小便量在5w+3d-12w均显著性升高(P0.01)。与正常组相比,模型组大鼠皮肤毛发、行为状态、情绪反应、舌质、臀尾色泽变化积分在5w+3d-12w时均呈显著性升高(P0.01)。(2)T2DM模型基础指标变化：与正常组相比,模型组大鼠FPG、IRI在5w+3d-12w均显著性升高(P0.01),Fins、HbA1c在8w-12w均显著性升高(P0.01),IAI在5w+3d-12w均显著性降低(P0.01)。(3)胰岛素调节因子变化：与正常组相比,模型组大鼠IDE、GC在5w+3d有升高趋势(P0.05),在8w-12w均显著性升高(P0.01),血清SS在8w-12w显著性降低(P0.01)。(4)脂代谢变化：与正常组相比,模型组血清TG、TC、LDL-C在10w-12w均显著性升高(P0.01),HDL-C在8w-12w均显著性降低(P0.01),血清FFA在5w+3d-12w均显著性升高(P0.01),Aop-A在10w-12w均显著性降低(P0.01)。(5)血液相关酶变化：与正常组相比,模型组大鼠Na+-K+-ATPase、SOD在5w+3d-12w均显著性降低(P0.01),iNOS在5w+3d-12w均显著性升高(P0.01)。 (6)细胞因子变化：与正常组相比,模型组大鼠CRP、Leptin在5w+3d-12w均显著性升高(P0.01),血清RPB4在10w-12w均显著性升高(P0.01),NF-κB在8-12w均显著性升高(P0.01)。(7)血液及血管调节因子变化：与正常组相比,模型组血清Hcy、血浆FIB在10w-12w均显著性升高(P0.01),血浆TXB2、血清Renin在12w显著性升高(P0.01),血浆6-keto-PGF1α在1 2w显著性降低(P0.05)。(8)HPA轴变化：与正常组相比,模型组血清ACTH、CORT在8-12w均显著性升高(P0.01)。 (9)其他指标变化：与正常组相比,模型组血浆cAMP在8w-12w显著性降低(P0.01),cGMP、cAMP/cGMP在8w-12w均显著性升高(P0.01)；血清Resistin、musclin在8-12w均显著性升高(P0.01)。 (10)IR相关指标变化：与正常组相比,模型组肝脏GLUT2和InsR在5w+3d-12w显著降低(P0.01)；脂肪GLUT4在10w-12w显著性降低(P0.05或P0.01),脂肪InsR数量在5w+3d、10w-12w显著降低(P0.01)；组肌肉GLUT4、InsR数量在12w显著降低(P0.01)。结论：采用高脂饲料喂养+小剂量STZ腹腔注射的方法复制的2型糖尿病大鼠模型具有典型的临床糖尿病特点：并先后出现“三多一少”、高血糖、高胰岛素血症、高胰高血糖素、高血脂、高血压,且伴有抓握力的降低；模型大鼠在造模期间先后出现靶器官肝脏→脂肪→肌肉的IR。该模型同时具有中医证候阶段性变化的特点,即出现中医证候及其相应的病生理学指标的改变,其阶段性的中医证候病机演变规律为中医气阴两虚证→气阴两虚兼痰浊证→气阴两虚兼痰浊、血瘀证。研究二基于数据分析对2型糖尿病演变中不同时相的中医证候内涵表征的探讨方法：采用直观比较、决策树和信息增益／信息熵分析法对2型糖尿病模型的实验指标及数据进行不同纬度的分析。结果：(1)直观比较法：模型组和正常组比较有显著差异的：在5w+3d, BP、Food、 Water、Defecation、Urine、FPG、IAI、IRI、FFA、Leptin、iNOS、Na+ -K+ -ATPase、SOD、 CRP、IDE、Liver-GLUT2、Liver-InsR、TC、Fat-Ins R;在第8w, BP、Food、Water、 Defecation、Urine、FPG、IAI、IRI、FFA、Leptin、iNOS、Na+-K+-ATPase、SOD、CRP、 Liver-GLUT2、Liver-InsR、Fins、GC、cAMP/cGMP、NF-κB、HbA1c、COR、Resistin、 Musclin、ACTH、IDE、SS;在第10w, BP、Food、Water、Defecation、Urine、FPG、 IAI、IRI、FFA、Leptin、iNOS、Na+-K+-ATPase、SOD、CRP、Liver-GLUT2、Liver-InsR、 Fins、GC、cAMP/cGMP、NF-κB、HbA1c、CORT、Resistin、Musclin、ACTH、IDE、 SS、Fat-Ins R、weight、Grip、TG、TC、HDL-C、LDL-C、Apo-A、FIB、Hcy、RPB4、 Fat-GLUT4;第12w, BP、Food、Wate、Defecation、Urine、FPG、IAI、IRI、FFA、 Leptin、iNOS、Na+-K+-ATPase、SOD、CRP、Liver-GLUT2、Liver-InsR、Fins、GC、 cAMP/cGMP、NF-κB、HbA1c、CORT、Resistin、Musclin、ACTH、IDE、SS、Fat-Ins R、 weight、Grip、TG、TC、HDL-C、LDL-C、Apo-A、FIB、Hey、RPB4、Fat-GLUT4、 TXB2、6-keto-PGF1a、Renin、Muscle-InsR、Muscle-GLUT4、Amylin。模型组内与前一阶段比较：1)与5w+3d比,第8w模型组有统计学意义的指标有BP、Weight、Water、 Urine、IAI、IRI、SOD、Liver-InsR、Defecation、cAMP/cGMP、iNOS、FPG、Fins、Renin、 Food;2)与8w比,第10w模型组有统计学意义的是Weight、BP、Grip、Water、Food、 Urine、IAI、IRI、TG、TC、HDL-C、LDL-C、Apo-A、FIB、SOD、Liver-InsR; 3) 与10w比,第12w模型组有统计学意义的是BP、Grip、TXB2、LDL-C、Fat-GLUT4、Muscle-Ins R、Muscle- GLUT4、Amylin。(2)决策树分析：正常组和模型决策树共有4个节点,涉及到的指标是IAI、BP、tizhong (Weight)和cAMP/cGMP。其中,IAI可以很好的区分正常组和4个模型组；IAI和cAMP/cGMP可以较好地区分模型第一阶段(M1)和模型第2阶段(M2); IAI、BP和Weight可以较好地区分模型第2阶段(M2)和模型第三阶段(M3)；IAI和BP可以较好地区分模型第三阶段(M3)和模型第四阶段(M4)。经计算其正确分类实例率达98.75%,具有可信度。模型各个阶段决策树共有3个节点,涉及到的指标是BP和Weight。其中BP可以很好的区分M1和M4,BP和Weight可以很好区分M2和M3。(3)信息增益/信息熵分析：正常组与模型组比较各阶段有强区分力的指标：1)IRI、IAI和FGP对于M1和N1具有很好的区分力,而SOD、CRP、Leptin、Water、 Gripe、iNOS和Defecation对于M1和N1具有也较好的区分力；2)IRI、HbA1c、IAI、BP、 FPG、cAMP/cGMP对于M2和N2具有很好的区分力,而Resistin、CORT、FFA、iNOS、 CRP、SOD、Musclin、Leptin、Fins、NF-κB、Gripe、Defecation、Na+-K+-ATPase、Urine、 Food、Water对于M2和N2具有也较好的区分力；3) IRI、BP、Weight、IAI、CORT、 CRP、HbA1c、FPG、cAMP/cGMP对于M3和N3具有很好的区分力,而iNOS、Resistin、 Leptin、TG、FIB、FFA、LDL、NF-κB、HDL、TC、Gripe、Apo-A、Food、Na+-K+-ATPase、 SOD、Urine、Defecation、Water对于M3和N3具有也较好的区分力；4) IRI、BP、IAI、 HbA1c、Weight、FPG对于M4和N4具有很好的区分力,而Resistin、GC、Fins、TC、CORT、 cAMP/cGMP、Fat-GLUT4、TXB2、TG、Fat-InsR、iNOS、SOD、FFA、Liver-GLUT2、 Muscle- InsR、IDE、Muscle-GLUT4、Defecation、Urine、Water、Gripe、Food、Na+-K+-ATPase、 FIB、Apo-A对于M4和N4具有也较好的区分力。模型组内各阶段间的指标区分力：cAMP/cGMP对于M1和M2具有很好的区分力,而BP、Weight、FPG、IRI、Urine、Food、 Gripe、IAI、Water对于M1和M2具有较好的区分力；Weight对于M2和M3具有很好的区分力,而FPG、Apo-A、TG、LDL、FIB、Gripe、Urine、Water对于M2和M3具有较好的区分力；BP、Muscle-GLUT4、Muscle-InsR对于M3和M4具有较好的区分力。结论：综合三种分析结果,从疾病的病生理角度可以概括出该模型的表征：即该模型以伴有多食-多饮-多尿及高血压为主要表现,以糖脂代谢异常、氧化应激和神经-内分泌异常为基本病理,同时出现早期以氧化应激损伤-副交感与肾上腺皮质激活(早期)-肝脏IR,中期以脂代谢-凝血功能异常-体重降低-脂肪IR,后期以胰岛功能损伤-血管调节异常-肌肉组织IR等为主要病变的先后病理演变进程。研究三2型糖尿病大鼠模型不同时相动态干预的方药效应比较方法：健康雄性SD大鼠300只,随机分为正常组60只和造模组240只。其中正常组给予基础饲料喂养,造模大鼠给予高脂高糖饲料,连续5w。第6w,造模组给予一次性腹腔注射STZ溶液。注射STZ后第三天,尾静脉采血检测大鼠空腹血糖,选择空腹血糖≥11.1mmol/L的大鼠正式纳入模型组。分别从正常组和模型组中随机挑选12只大鼠,麻醉经腹主动脉采血,待测相关指标。给药第1阶段(7-8w)：从正常组随机挑选12只大鼠,模型组随机挑选60只大鼠,随机分为模型组、中药A方组、中药B方组、中药C方组和西药组,中药三组分别给于A方、B方、C方灌胃；西药组给予盐酸吡格列酮灌胃,于第8w末禁食8小时后腹腔麻醉,经腹主动脉采血检测相关指标。给药第2阶段(9-10w)：从正常组随机挑选12只大鼠,模型组随机挑选60只大鼠,随机分为模型组、中药A方组、中药B方组、中药C方组和西药组,中药三组分别给于A方、B方、C方灌胃；西药组给予盐酸吡格列酮灌胃,于第10w末禁食8小时后腹腔麻醉,经腹主动脉采血检测相关指标。给药第3阶段(11-12w)：从正常组随机挑选12只大鼠,模型组随机挑选60只大鼠,随机分为模型组、中药A方组、中药B方组、中药C方组和西药组,中药三组分别给于A方、B方、C方灌胃；西药给予盐酸吡格列酮灌胃,于第12w末禁食8小时后腹腔麻醉,经腹主动脉采血检测相关指标。结果：第一阶段,与正常组相比,模型组大鼠BP显著升高,饮食、饮水、大便、小便量显著增加；FGB、Fins、IRI显著升高,IAI显著性降低；IDE、GC显著升高,SS显著降低；Na+-K+-ATPase、SOD显著降低,iNOS显著升高；CRP、Leptin、FFA显著升高；cGMP显著升高,cAMP、cAMP/cGMP显著降低。中药A方可改善模型组显著变化的BP、FGB、Fins、IRI; IDE、GC; Na+-K+-ATPase、SOD、iNOS; CRP、Leptin、 FFA; cAMP、cGMP、cAMP/cGMP;中药B方可改善模型组显著变化的BP; Fins、IRI、 IDE; Na+-K+-ATPase、SOD、iNOS; CRP; cGMP、cAMP/cGMP;中药C方可改善模型组显著变化的BP、FGB、IRI、Na+-K+-ATPase、SOD、iNOS、CRP、cGMP、cAMP/cGMP。第二阶段,与正常组相比,模型组大鼠体重、抓握力显著降低、BP显著升高,饮食、饮水、大便、小便量显著增加；FGB、Fins、IRI显著升高,IAI显著性降低；IDE、GC显著升高,SS显著降低；Na+-K+-ATPase、SOD显著降低,iNOS显著升高；CRP、 Leptin显著升高；TG、TC、LDL-C、RPB4、FFA显著升高,HDL-C、apo-A显著降低；FIB、Hcy显著升高；cGMP显著升高cAMP、cAMP/cGMP显著降低。中药A方可改善模型组显著变化的体重、BP、Fins、IRI; Na+-K+-ATPase、SOD、iNOS; CRP。中药B方可改善模型组显著变化的体重、饮食量、BP; FGB、Fins、IRI、IDE、SS; Na+-K+-ATPase、 SOD、iNOS；CRP、Leptin；TG、TC、LDL-C、HDL-C、RPB4、FFA、apo-A; Hcy; cGMP、cAMP/cGMP。中药C方可改善模型组显著变化的体重、BP; Fins、IRI、IAI、 IDE、SS; Na+-K+-ATPase、SOD、iNOS; CRP、Leptin; TG、TC、LDL-C、FFA; cGMP。第三阶段,与正常组相比,模型组大鼠体重、抓握力显著降低、BP显著升高,饮食、饮水、大便、小便量显著增加；FGB、Fins、IRI显著升高,IAI显著性降低；IDE、GC显著升高,SS显著降低；Na+-K+-ATPase、SOD显著降低,iNOS显著升高；CRP、Leptin显著升高；TG、TC、LDL-C、RPB4、FFA显著升高,HDL-C、apo-A显著降低；TXB2、 FIB、Hey显著升高,6-Keto-PGF1c显著降低；cGMP显著升高cAMP、cAMP/cGMP显著降低。中药A方可改善模型组显著变化的BP、抓握力、饮食、饮水量；FGB、IRI; Na+-K+-ATPase、SOD、iNOS。中药B方可改善模型组显著变化的BP、抓握力、饮食、饮水、大便、小便量；FGB、Fins、IRI、IAI; Na+-K+-ATPase、SOD、iNOS; TG、TC、 FIB; cGMP、cAMP/cGMP。中药C方可改善模型组显著变化的体重、BP、抓握力、饮食、饮水、大便、小便量；FGB、Fins、IRI、IAI; IDE、GC、SS; Na+-K+-ATPase、SOD、 iNOS; Leptin; TG、TC、LDL-C、HDL-C、FFA、apo-A; TXB2、FIB、Hcy,6-Keto-PGF1c; cAMP、cGMP、cAMP/cGMP。结论：A、B、C三方对模型发展中三个阶段的证候均有一定的干预效果,其中A方对第一阶段的作用最好,B方对第二阶段的作用最好,C方对第三阶段的干预效果最好。结果表明,A、B、C三方的防治效果因证有异,三方与模型不同阶段中的三证均存在一定的关联,但其关联程度有所不同。A、B、C方分别与模型第一、第二和第三阶段的证候有更高的关联性,与实验前针对三个阶段设定的A、B、C三个目标方的作用预期相符,也与中医益气养阴与气阴两虚证、益气养阴化痰与气阴两虚兼痰浊证、益气养阴化痰祛瘀与气阴两虚兼痰瘀证的经验是一致的。推论中医因证立法、选方用药的辨治经验有其充分的合理性和丰富的科学内涵。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R259;R-332

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