轴突生长抑制蛋白在听觉剥夺大鼠听皮层中的表达及其对听皮层可塑性调控作用的实验研究

发布时间：2018-05-10 22:22

  本文选题：听觉剥夺 + 轴突生长抑制蛋白　； 参考：《河北医科大学》2014年硕士论文

【摘要】：目的： 本研究通过建立双侧耳蜗手术损毁所致听觉剥夺（AuditoryDeprivation, AD）动物模型，对中枢神经系统中三种重要轴突生长抑制蛋白勿动蛋白多肽因子-A（Nogo-A）、髓鞘相关糖蛋白（MAG）、少突胶质细胞髓鞘糖蛋白（Omgp）及其共同受体Nogo-66受体（NgR）在听皮层中表达水平的变化情况进行观察，探究轴突生长抑制蛋白与听皮层可塑性之间的关系，并为听皮层可塑性机制的进一步探索提供一定的理论依据。 方法： 选取72只生后两周龄健康雄性且耳廓反射正常的SD乳鼠进行实验。随机分为实验组和对照组，每组各36只。实验组乳大鼠麻醉后，施行双侧耳蜗损毁手术，对照组在相同条件下，只做双侧耳后切口，不损坏耳蜗。根据动物术后饲养的时间不同将对照组和实验组又分别分为2、4、6、8周四个小组，每个小组9只动物。实验动物均置于温度、湿度适宜的屏蔽环境中喂养。实验组与对照组分别于术后两周进行ABR检测，将引出Ⅲ波等重复波形的最小刺激强度定为ABR反应阈，判断动物模型是否成功建立。采用蛋白免疫印迹技术、实时荧光定量PCR技术、以及免疫荧光组织化学技术分别于术前及术后2、4、6、8周检测实验组与对照组大鼠听皮层Nogo-A、MAG、Omgp、NgR的蛋白及mRNA表达水平的变化。 结果： 1耳蜗损毁手术结果： 术后大鼠进食、饮水等活动正常，两周后无头颈歪斜，拎尾悬空能保持平衡，无原地反复转圈等前庭功能损害的表现。实验组大鼠较正常组大鼠行动迟缓，耳廓反射消失且对噪声刺激不敏感。 2ABR检测结果： ABR测试结果显示对照组大鼠双耳40SPL dB能引出重复波形，听阈为40dB，而实验组大鼠双耳90SPL dB无法引出重复波形，听阈大于90dB，按依据1980年WHO对耳聋的分级标准，测听听阈超过90dB为全聋，本研究实验结果表明耳蜗损毁手术所致大鼠听觉剥夺动物模型建造成功。 3免疫荧光组织化学检测结果： Nogo-A、MAG、Omgp、NgR在大鼠听皮层的神经元与脑内神经纤维髓鞘中有表达，阳性细胞呈现多细胞形态，有神经元细胞形态、条索状神经纤维髓鞘形态或两者共存。Nogo-A及Omgp的阳性信号分布在细胞膜和神经纤维髓鞘，呈现出神经元细胞形态及条索状神经纤维髓鞘形态。MAG阳性细胞仅为条索状神经纤维形态，阳性信号在神经纤维髓鞘分布，NgR阳性细胞仅为神经元形态，阳性信号在细胞膜及胞质中均有分布。对2、4、6、8周实验组及对照组阳性细胞计数得：实验组Nogo-A蛋白平均光密度值AOD依次为0.254、0.368、0.591、0.510，，对照组依次为0.233、0.313、0.427、0.368。实验组NgR AOD值依次为0.390、0.445、0.602、0.507，对照组依次为0.346、0.416、0.529、0.452。实验组MAG AOD值依次为0.366、0.471、0.642、0.513，对照组依次为0.318、0.418、0.603、0.442。实验组Omgp AOD值依次为0.304、0.481、0.644、0.520，对照组为0.270、0.415、0.560、0.424。激光共聚焦扫描成像显示实验组与对照组Nogo-A、MAG、Omgp、NgR阳性细胞数目均有随时间延长而增加的趋势，且三种轴突生长抑制蛋白Nogo-A、MAG、Omgp及其受体NgR增多趋势相似，其阳性细胞数均于术后6周左右达到峰值，且其实验组与对照组相比，蛋白表达的平均光密度值显著增加。 4实时荧光定量PCR检测结果： Nogo-A、MAG、Omgp及其受体NgR mRNA的熔解曲线分析图可以看出，各图中仅出现目标基因以及内参GAPDH的两个单一峰，无杂峰和其他产物出现的非特异性荧光，说明本实验定量准确。实验组与对照组Nogo-A、MAG、Omgp、NgR mRNA的原始Ct值均有明显下降趋势，Ct值越低，表达量越高。Nogo-A和Omgp mRNA的Ct值于术后6周降至最低点，MAG和NgR mRNA的Ct值于术后4周降至最低点，而且Nogo-AmRNA术后各实验组Ct值明显低于各对照组。NgR与MAG mRNA术后2、4周实验组Ct值明显低于其对照组，Omgp mRNA术后2、4、6周的实验组Ct值明显低于其对照组。以对照2周组大鼠做校准，根据2-Ct法计算实验各小组目的基因的相对表达量得到：实验组2、4、6、8周Nogo-A mRNA的2-Ct均值分别为1.323，2.085，2.792，2.077，NgR为2.028，2.276，1.833，1.688， MAG为1.351，2.809，1.906，1.331，Omgp为1.298，1.616，2.389，1.878。结合目的基因原始Ct值和2-Ct值可以看出Nogo-A、MAG、Omgp及其受体NgR mRNA无论手术与否表达均有随时间增高趋势，MAG和NgR mRNA于术后4周达到峰值，Nogo-A和Omgp mRNA于术后6周达到峰值，达峰后目的基因表达均开始下降，且实验组四个目的基因表达量均显著高于对照组。 5Western Blot检测结果： 在200kD，100kD，25kD，66kD处分别呈现Nogo-A、MAG、Omgp、NgR特异性蛋白表达条带。以GAPDH（37kD）作为内参校正上样量的一致性，2、4、6、8周实验组Nogo-A灰度比均值分别为0.275、0.389、0.460、0.343，对照组为0.110、0.131、0.162、0.122。实验组NgR为0.097、0.107、0.149、0.120，对照组为0.065、0.070、0.081、0.072。实验组MAG为0.248、0.365、0.478、0.327，对照组为0.195、0.257、0.309、0.276。实验组Omgp为0.173、0.320、0.405、0.3445，对照组为0.092、0.257、0.309、0.276。结果显示Nogo-A、MAG、Omgp及其受体NgR的蛋白表达随年龄增长有相似的增加趋势，实验组与对照组均在6周组出现峰值，随后实验组与对照组表达均开始下调。Nogo-A、Omgp、NgR蛋白表达2、4、6、8周实验组与对照组相比明显增高，差异均有统计学意义。MAG蛋白表达4、6周实验组与对照组相比表达量均明显增高。 结论： 1双侧耳蜗损毁手术是一种建立听觉剥夺大鼠模型的既稳定又可靠的方法。 2三种轴突生长抑制蛋白及其受体在大鼠听皮层有表达。 3正常发育的大鼠在听觉发育关键期听皮层即有轴突生长抑制蛋白Nogo-A、MAG、Omgp及其受体NgR的表达，随生长发育表达逐渐升高并于生后4～6周达到峰值，随后表达开始下调，这可能是因为生后发育早期以及听觉发育关键时期，轴突生长抑制蛋白及其受体介导轴突伸长，对神经纤维及轴突的作用以修复、促进为主，随着发育至成年以后，轴突生长抑制蛋白及受体的作用逐渐转变为抑制轴突过度生长。 4耳蜗损毁所致听觉剥夺的大鼠，外周听器损伤后，听皮层轴突生长抑制蛋白Nogo-A、MAG、Omgp及其受体NgR的表达与正常发育至相同时间的大鼠相比显著升高，达峰时间与正常发育大鼠相似但表达量明显增高。这可能是因为耳蜗损毁导致外周听器损伤初期，轴突生长抑制蛋白及其受体主要参与修复神经纤维、促进神经及轴突生长的过程，当新的突触与髓鞘逐步形成，听皮层逐步建立起新的神经网络后，表达开始逐渐下调，此后对神经纤维及轴突的作用以抑制过度生长为主，这也说明外周听器损伤确实可导致高级听觉中枢的可塑性变化，而且轴突生长抑制蛋白及其受体参与了听皮层神经元可塑性调控，同时也间接证明了大鼠听皮层是一个具有高度可塑性的大脑皮层特异性功能区域。
[Abstract]:Objective:
In this study, by establishing AuditoryDeprivation (AD) animal model of bilateral cochlear surgery, three important axon growth inhibitory protein (Nogo-A), myelin related glycoprotein (MAG), oligodendrocyte myelin glycoprotein (Omgp) and its common receptor Nogo-66 receptor (NgR) in the central nervous system were established in the central nervous system. To observe the changes in the level of expression in the auditory cortex and explore the relationship between the axon growth inhibitory protein and the plasticity of auditory cortex, and provide some theoretical basis for the further exploration of the mechanism of auditory cortex plasticity.
Method锛

本文编号：1871185