白藜芦醇对SOD1-G93A小鼠腰髓和运动皮层Bcl-2、Bax表达水平的影响

发布时间：2018-05-18 20:32

  本文选题：肌萎缩侧索硬化 + 细胞凋亡　； 参考：《河北医科大学》2014年硕士论文

【摘要】：目的：肌萎缩侧索硬化（Amyotrophic lateral sclerosis, ALS）是一种进行性加重的，主要累及上、下运动神经元（主要包括脊髓、脑干、运动皮层）的神经系统变性疾病，其典型临床表现为逐渐进展的肌肉无力、萎缩，感觉系统及括约肌功能一般不受影响。随着疾病的进展，成人常在发病后3-5年因累及呼吸肌而死亡，目前尚无有效的治疗手段。ALS分为两种类型：散发型和家族型,散发型约占所有确诊病人的90%-95%，家族型约占5%-10%，其中约20%的家族型ALS已被证实与Cu/Zn超氧化物歧化酶（SOD1）基因突变有关。目前关于ALS的病因及发病机制尚不是特别明确，亦可能是多种机制共同参与，其中包括遗传、氧化应激反应、谷氨酸兴奋毒性作用、线粒体功能障碍、异常蛋白质聚集和降解障碍、Ca2+超载、轴索运输障碍、细胞凋亡等。在前期，我们实验室详细介绍了线粒体功能障碍包括线粒体分裂、融合以及线粒体自噬在ALS发展过程中变化及作用，但是不管是线粒体分裂、融合、自噬，还是其他各种机制均有可能通过诱发细胞凋亡途径导致ALS疾病发生和发展。 细胞凋亡（apoptosis）是机体为了维持内环境稳态、生长发育所必需的生理过程。机体在生长发育过程中，细胞会新陈代谢，在产生新细胞同时，发生突变或者老化细胞就可以通过细胞凋亡机制而被清除，从而维持机体正常稳态及功能。细胞凋亡主要包括三种途径：死亡受体凋亡途径、线粒体凋亡途径、内质网凋亡途径，而线粒体凋亡途径是目前研究热点。Bcl-2家族主要作用位点在线粒体膜上，在线粒体凋亡途径中起重要作用。Bcl-2家族蛋白分为抗凋亡蛋白以及促凋亡蛋白两类，其中Bcl-2属于众多抗凋亡蛋白中的一种，Bax是促凋亡蛋白的一种，当细胞受到异常信号刺激时，Bax构象发生变化，从胞质易位至线粒体外膜上，形成膜通道结构导致细胞色素C的释放，从而引起细胞凋亡。有研究证实，在阿尔茨海默病（Alzheimer disease AD）、帕金森病（Parkinson disease PD）、ALS动物模型中，Bax、Bcl-2表达均发生了一定的变化。在ALS动物模型中，通过抑制Bax基因表达，影响线粒体凋亡途径，不仅减少了运动神经元的丢失，并且对于改善轴突变性、延长生存期也起到一定作用。白藜芦醇是二苯基乙烯家族中一类多酚类化合物，在心血管疾病、癌症、衰老、神经退行性疾病等方面具有有益作用。在朊蛋白病动物模型中，白藜芦醇能够减少促凋亡蛋白Bax易位至线粒体外膜上，阻止细胞色素C的释放，保护神经元。那么ALS同样作为一种神经变性病，，随着其疾病进展，细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达发生了怎样变化？白藜芦醇对Bcl-2、Bax又产生了怎样的影响？有待本实验进一步证实。 SOD1-G93A转基因小鼠是目前研究ALS最为理想的动物模型之一。本实验旨在观察不同时期SOD1-G93A小鼠腰髓及运动皮层中Bax、Bcl-2动态变化情况；以及给予白藜芦醇处理后小鼠腰髓及运动皮层中两者表达情况的变化；进一步探讨细胞凋亡在ALS发病过程中的作用；最后评估应用白藜芦醇对ALS治疗可行性。 方法：选取SOD1-G93A转基因小鼠为实验组，根据病程分为症状前期（60天）组、症状早期（Onset）组、终末期（End）组，选取90d野生型小鼠作为对照组，各组6只；处理组选取70d SOD1-G93A转基因小鼠，分为白藜芦醇组、溶剂组、空白组，每组根据给药时间不同分2个亚组，每组6只，白藜芦醇组给予白藜芦醇乙醇溶液(30mg/kg/d）胃内灌注、溶剂组给予同等体积的乙醇溶液胃内灌注、空白组不予任何处理,分别连续灌注至症状早期（连续给药20-30天）、终末期（连续给药50-60天）后取材，以10%水合氯醛(350mg/Kg体重)腹腔注射麻醉，处死小鼠，取腰髓及运动皮层迅速投入液氮冷冻，之后保存于-80℃冰箱；4%多聚甲醛经心脏灌注，之后剥离小鼠腰髓及运动皮层，用4%多聚甲醛浸泡保存或用2.5%戊二醛固定组织，利用Western blot技术、免疫组织化学技术和激光共聚焦技术观察SOD1-G93A转基因小鼠腰髓与运动皮层中Bcl-2和Bax的动态表达情况及给予白藜芦醇后SOD1-G93A转基因小鼠腰髓与运动皮层中Bcl-2和Bax的变化情况。并利用spss13.0对数据进行分析。 结果： 1.不同时期Bcl-2、Bax在SOD1-G93A小鼠腰髓及运动皮层中表达情况 （1）Bcl-2、Bax在SOD1-G93A小鼠腰髓及运动皮层运动神经元中表达情况：通过免疫组织化学染色发现，与对照组相比，症状早期组和终末期组运动神经元中Bcl-2表达量降低，而Bax表达量升高；与对照组相比，症状前期组运动神经元中Bcl-2和bax表达量无明显改变。激光共聚焦技术检测Bcl-2、Bax与神经元标记物SMI32共定位情况：与对照组相比，症状早期组和终末期组Bcl-2在运动神经元中表达量降低，而Bax在运动神经元中表达量升高；与对照组相比，症状前期组Bcl-2、Bax在运动神经元中表达量无明显变化。 （2）SOD1-G93A转基因小鼠腰髓及运动皮层中总的Bcl-2、Bax的含量：与对照组相比，终末期组Bcl-2含量明显减少，差异有统计学意义，症状早期组及症状前期组Bcl-2含量无明显变化，差异无统计学意义；与对照组相比，终末期组和症状早期组Bax含量均增多，具有统计学意义，症状前期Bax含量无明显变化，无统计学意义。 2.给予白藜芦醇干预后不同时期SOD1-G93A小鼠腰髓及运动皮层中Bcl-2和Bax表达情况 （1）症状早期：通过免疫组织化学染色发现，应用白藜芦醇干预后，在SOD1-G93A小鼠腰髓及运动皮层运动神经元中，与空白组相比，白藜芦醇组及溶剂组Bcl-2表达量升高，而运动皮层中Bax表达量降低；与溶剂组相比，白藜芦醇组Bcl-2和Bax表达量无明显变化。激光共聚焦技术检测Bcl-2、Bax与神经元标记物SMI32共定位情况：在SOD1-G93A小鼠腰髓运动神经元中，与空白组相比，白藜芦醇组及溶剂组Bcl-2表达量升高，而Bax表达降低；与溶剂组相比，白藜芦醇组Bcl-2和Bax在运动神经元中表达量无明显变化。Western blot技术检测发现：与空白组相比，在SOD1-G93A小鼠腰髓中，白藜芦醇组与溶剂组Bcl-2含量升高，而Bax含量降低，差异有统计学意义；与溶剂组相比，白藜芦醇组Bcl-2和Bax含量无明显变化，差异无统计学意义。 （2）终末组：通过免疫组织化学染色发现，应用白藜芦醇干预后，在SOD1-G93A小鼠腰髓及运动皮层运动神经元中，与空白组相比，白藜芦醇组及溶剂组Bcl-2表达量升高，而运动皮层中Bax表达量降低；与溶剂组相比，白藜芦醇组Bcl-2和Bax表达量无明显变化。激光共聚焦技术检测Bcl-2、Bax与神经元标记物SMI32共定位情况：在SOD1-G93A小鼠腰髓运动神经元中，与空白组相比，白藜芦醇组及溶剂组Bcl-2表达量升高,而Bax表达量降低；与溶剂组相比，白藜芦醇组Bcl-2和Bax在运动神经元中表达量无明显变化。Western blot技术检测发现，在SOD1-G93A小鼠腰髓中，白藜芦醇组、溶剂组、空白组三组Bcl-2和Bax含量无明显变化，差异无统计学意义。 结论： 1.随着ALS疾病的进展，SOD1-G93A基因小鼠中枢神经系统运动神经元中抗凋亡蛋白Bcl-2水平降低，促凋亡蛋白Bax水平升高，提示在ALS疾病进展过程中，通过线粒体途径介导的细胞凋亡增加。 2.白藜芦醇在疾病早期及终末期通过干预线粒体凋亡途径来治疗ALS作用有限。
[Abstract]:Objective : Amyotrophic lateral sclerosis ( ALS ) is a kind of neurodegenerative disease with progressive emphasis , mainly involving upper and lower motor neurons ( mainly including spinal cord , brain stem , motor cortex ) . The typical clinical manifestations of ALS are progressive muscle weakness , atrophy , sensory system and sphincter function . In the early stage , the family type ALS has been confirmed to be related to the mutation of Cu / Zn superoxide dismutase ( SOD1 ) .

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本文编号：1907107