W1对血小板ADP受体信号通路的影响及有关药物研究

发布时间：2018-05-27 05:24

本文选题：W1 + 氯吡格雷　；参考：《广西医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：W1作为一个新型合成化合物,其结构包含2-O-氯吡格雷和阿司匹林,前者为氯吡格雷在体内的第一步氧化代谢产物。W1的合成理念主要基于氯吡格雷的前药属性,且其代谢产物的不稳定性,旨在减轻或克服氯吡格雷临床使用中存在的主要问题。氯吡格雷在临床上广泛应用于抗血栓治疗,其体内活化过程需要经过肝脏CYP450酶的两步氧化代谢,其代谢酶的主要亚型为CYP2C19和CYP3A4。因此,氯吡格雷的药效通常受到机体CYP450酶活性的影响,比如患者出现上述酶活性先天不足或配伍给药使得酶活性被抑制的情形,后者包括质子泵抑制剂(如奥美拉唑)或降胆固醇药物(如他汀类药物)等临床常用药物,这些因素皆可使氯吡格雷无法达到预期疗效,即出现“氯吡格雷抵抗”现象,这已成为氯吡格雷最令人担心的问题。我们前期的药效学研究表明,W1具有强于氯吡格雷的抗血小板效应,而且能够明显减轻“氯吡格雷抵抗”现象。本研究主要就W1的作用机制进行分析,着重观察其对血小板ADP受体P2Y12信号通路的影响,此外,还对可能影响氯吡格雷药效的配伍药物奥美拉唑和辛伐他汀进行了相关研究。第一部分,W1对血小板ADP受体信号通路的影响。我们以Wistar大鼠为实验对象,将动物分为三个组:正常对照组、氯吡格雷组(10mg/kg)和W1组(3mg/kg),氯吡格雷和W1分别以0.5%的甲基纤维素(MC)溶液充分混悬,二者均为单次给药,采用灌胃口服途径,正常对照组仅服用等体积的MC混悬液。各组动物给药后4小时,麻醉并抽取腹主动脉血液,离心制备洗涤血小板,分别用于adp受体信号通路分子的蛋白表达检测和血小板铺展实验。在信号分子的蛋白表达检测中,各组动物血小板以adp(终浓度为50μm)处理5分钟,正常对照动物血小板另设非adp处理组。adp处理完毕,提取血小板蛋白,通过westernblot方法检测磷酸化akt、erk蛋白以及rap1蛋白的表达情况。在进行血小板铺展实验时,以fitc-鬼笔环肽染色血小板,在激光共聚焦显微镜下对血小板加以观察,通过测定单个血小板面积反映其铺展情况。westernblot检测结果表明,与正常对照组相比,w1给药组大鼠血小板的磷酸化akt、erk蛋白及rap1蛋白的表达均受到抑制,氯吡格雷组可观察到同样的结果。激光共聚焦显微镜观察结果显示,与正常对照组相比,w1及氯吡格雷给药组大鼠血小板的面积明显减小,表明w1可以抑制血小板在纤维蛋白原上的铺展,阻断了纤维蛋白原受体的活化。第二部分,辛伐他汀对氯吡格雷的影响。将wistar大鼠分为三组:氯吡格雷(10mg/kg)组、氯吡格雷(10mg/kg)+辛伐他汀(40mg/kg)组、氯吡格雷(10mg/kg)+辛伐他汀(80mg/kg)组,各组均为单次灌胃口服给药。按照第一部分的主要方法,观察辛伐他汀配伍给药对氯吡格雷的影响。结果表明,大鼠血小板在akt磷酸化蛋白表达及面积变化方面,未检测到辛伐他汀对氯吡格雷产生显著影响。为进一步分析原因,一方面,我们将辛伐他汀(10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5m)作用于hepg2培养细胞,分别以q-pcr及westernblot检测细胞cyp3a4在mrna和蛋白的表达水平;另一方面,将辛伐他汀(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5m)与表达人cyp450s同工酶和人cyp450s还原酶的昆虫细胞微粒体共同孵育,通过荧光强度的变化分析辛伐他汀对cyp3a4酶活性的影响。结果表明,辛伐他汀没有影响到hepg2细胞cyp3a4在mrna和蛋白水平的表达,对体外肝微粒体cyp3a4的酶活性亦未产生明显影响。第三部分,奥美拉唑对HepG2细胞CYP2C19表达的影响。将奥美拉唑(0、0.1、1、10 mg/L)作用于HepG2细胞24小时,采用Q-PCR及Western blot检测细胞中CYP2C19的mRNA和蛋白表达。奥美拉唑(0、0.1、1、10、100 mg/L)与表达人CYP450s同工酶和人CYP450s还原酶的昆虫细胞的微粒体共同孵育,在体外水平上通过荧光强度的变化分析奥美拉唑对CYP2C19酶活性的影响。结果显示,在mRNA及蛋白表达水平上,奥美拉唑各浓度组均抑制CYP2C19酶的表达,且具有浓度依赖性。酶活性检测表明,当奥美拉唑的浓度达到10 mg/L、100 mg/L时,荧光强度明显减弱,表明高浓度的奥美拉唑抑制CYP2C19酶的表达。结论:W1可明显抑制大鼠血小板Akt、Erk及Rap1的蛋白表达,而它们正是ADP受体信号通路的重要分子,提示W1通过作用于ADP受体发挥其抗血小板作用;在大鼠体内未检测到辛伐他汀对氯吡格雷产生明显影响,包括在血小板的Akt表达和面积变化方面,而且对HepG2细胞CYP3A4的表达和对微粒体CYP3A4酶活性亦无影响;奥美拉唑能够降低HepG2细胞色素氧化酶CYP2C19的表达,也可抑制体外肝微粒体该酶的活性。
[Abstract]:In this study , the effect of clopidogrel on platelet ADP receptor signaling pathway was studied . The effect of clopidogrel on platelet ADP receptor signaling pathway was studied . The effects of simvastatin ( 10 - 10 , 10 - 9 , 10 - 8 , 10 - 7 , 10 - 6 , 10 - 5 m ) on the activity of clopidogrel in HepG2 cells were investigated . The results showed that simvastatin ( 10 - 10 , 10 - 9 , 10 - 8 , 10 - 7 , 10 - 6 , 10 - 5 m ) had no significant effect on the activity of human CYP450s and human CYP450s .
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R96

【参考文献】