慢性肾功能不全对巨噬细胞活化影响

发布时间：2018-06-04 00:48

  本文选题：慢性肾衰 + 微炎症　； 参考：《南方医科大学》2014年硕士论文

【摘要】：研究背景 慢性肾脏病(CKD)己成为一个全球公共卫生问题,其患病率逐年上升,全球范围内成年人的患病率达到10-16%。终末期肾病患者,尤其是接受透析治疗的患者死亡率与同龄正常人相比显著增加。而心血管疾病(CVD)是CKD患者的主要并发症和其死亡原因,其死亡率约占终末期肾脏病(ESRD)患者总死亡人数的50%,是普通人群的20倍。 近年研究发现,CKD随着肾功能的减退,机体在没有全身或局部显性的临床感染征象的情况下,出现持续低水平的炎症反应,即微炎症状态,主要表现为TNF-α和IL-6等炎症因子水平和C-反应蛋白(CRP)等正性急性时相反应物轻度持续增多。其本质是炎症反应失控。这种持续的微炎症与传统的由病原微生物引起的炎症有本质的区别,目前被统称为代谢性炎症。一些糖、脂、蛋白代谢产物在某些条件下成为诱导炎症的激活剂。有研究发现微炎症反应是增加CKD病人CVD等并发症发病风险的主要原因之一,与患者预后不良密切相关。 大量研究表明巨噬细胞在急慢性炎症中都发挥着重要的作用,巨噬细胞具有很强的可塑性可调节其表现型从而对环境信号做出快速有效的反应。根据巨噬细胞的功能表现型分为两种极性状态：M1即“经典活化型”巨噬细胞和M2型“转化型”巨噬细胞。M1型巨噬细胞由经典的免疫途径诱导激活(如LPS和IFN-γ),高表达iNOS,能促进炎症因子的产生,如TNF-α、IL-6、MCP-1等。M2型巨噬细胞可由IL-4和IL-13刺激产生。M2型巨噬细胞通过合成抗炎细胞因子IL-10、IL-1诱导性受体和M2型巨噬细胞表面标记分子(如CD206、 dectin-1)及内吞清除作用在炎症消退、组织修复及改善胰岛素敏感性中起重要作用[11,12]。 几乎所有的肾脏病都伴随着由炎症因子分泌和免疫细胞浸润引起的肾脏炎症[13]。然而慢性肾功能不全(CRF)机体存在的微炎症反应是否与巨噬细胞异常活化有关尚不清楚。 我们用5/6肾切除大鼠作为慢性肾功能衰竭模型,观察慢性肾衰大鼠巨噬细胞是否存在异常活化以及巨噬细胞对LPS和IL-4刺激的反应性的变化。目的在于探讨慢性肾衰对巨噬细胞活化的影响。 在正常大鼠腹腔来源巨噬细胞相关实验中,用相关浓度的尿毒症血清刺激巨噬细胞,观察巨噬细胞活化情况以及反应性的变化。 在人细胞株相关实验中：我们用人相关浓度的尿毒症血清刺激体外培养的THP-1巨噬细胞,观察巨噬细胞是否存在异常活化以及巨噬细胞对LPS和IL-4刺激的反应性的变化。为进一步探讨慢性肾衰对巨噬细胞活化的影响。 很多慢性病中(例如糖尿病、肥胖等)都存在线粒体损伤。AMPK/PGC-1α通路对线粒体再生合成以及功能起到了关键的作用。我们已有实验证明慢性肾衰大鼠巨噬细胞的线粒体结构和功能存在损伤,且AMPK/PGC-1α通路可能受到抑制,为了明确巨噬细胞表型的变化是否与慢性肾衰条件下巨噬细胞表型的变化是否与巨噬细胞的线粒体结构和功能存在损伤相关,我们用AMPK激动剂AICAR预先作用巨噬细胞后,再用相关浓度的尿毒症血清刺激巨噬细胞,观察巨噬细胞对LPS和IL-4刺激的反应性。 研究方法 第一部分：5/6肾切大鼠腹腔来源巨噬细胞相关实验 一、二步法5/6肾切除建立慢性肾衰模型 1、腹腔注射麻醉大鼠：给大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉,俯卧位定于鼠台上。 2、酒精消毒,于大鼠左腹部中1/3脊柱旁开2-3cm处行纵行切口,切口长度约为2-3cm。 3、依次切开皮肤和皮下组织,并剪开肌肉暴露肾脏,剥离肾包膜,用无损伤血管钳夹住肾蒂,切除肾脏的上下极约占左肾的2/3,明胶海绵压紧上下极创面止血,放松血管钳,观察创面不再渗血后还纳肾脏回腹腔,逐层缝合肌层及皮肤,酒精消毒手术切口。缝合前,腹腔内滴注青霉素注射液,预防感染。假手术组只做肾包膜剥离术。 4、一周后,在脊柱右侧中1/3旁开2-3cm纵行切口(切口略高于左侧),分离肌层,游离肾脏,无损伤血管钳夹住肾蒂,4号丝线结扎肾蒂,切除右侧肾脏,观察有无出血,缝合肌层和皮肤,酒精消毒手术切口。假手术组只做肾包膜剥离术。 二、大鼠血、尿留取及处理 1、术后第12周,测定大鼠血压后将大鼠放于代谢笼中,留取24小时尿。 2、腹腔注射麻醉大鼠：给大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉,仰卧位固定于鼠台上。 3、腹主动脉采血。 三、大鼠腹腔巨噬细胞的提取和纯度鉴定 1、大鼠腹腔巨噬细胞的提取 1)乙醚过度麻醉处死大鼠 2)75%酒精浸泡5分钟消毒 3)将大鼠倒立提起,从腹腔一侧稍下注入冰的DMEM培养液10ml,将大鼠仰卧轻柔大鼠腹部3分钟,静置7分钟,无菌条件下打开大鼠腹腔,观察肠管变扁且腹腔液为淡黄色时,抽吸腹腔液约7ml,800rpm离心5m,in,用DMEM培养液(含20%胎牛血清,青霉素100U/ml,链霉素100U/m1)调整细胞至所需浓度,37℃,5%CO2培养2小时换液,以去除少数未贴壁细胞。 2、流式细胞术鉴定大鼠腹腔巨噬细胞的纯度 收集细胞,经固定破膜后,加入FITC荧光标记的小鼠抗大鼠CD68直接标记抗体避光孵育,用非免疫FITC荧光标记的小鼠IgGl作同型对照,PBS/BSA(PH7.4含1%BSA的PBS)重悬细胞后,流式细胞仪检测。 四、慢性肾功能不全对大鼠腹腔巨噬细胞的活化及反应性的影响 1、大鼠腹腔巨噬细胞M1型标记物及对LPS刺激的反应性的检测 提取的Sham组和CRF组大鼠的腹腔巨噬细胞用LPS (1000ng/ml)刺激24小时,分为Sham组,CRF组,Sham+LPS组,CRF+LPS组。收集细胞,提取总RNA, RT-PCR检测M1型标记物(TNF-α、IL-6、MCP-1)的mRNA的表达。收集细胞上清,按试剂盒说明,用ELISE方法检测M1型标记物(TNF-α、IL-6、MCP-1)在细胞上清中的浓度,并以细胞总蛋白矫正。 2、大鼠腹腔巨噬细胞M2型标记物及对IL-4刺激的反应性的检测 提取的Sham组和CRF组大鼠的腹腔巨噬细胞用IL-4(100ng/ml)刺激24小时,分为Sham组,CRF组,Sham+IL-4组,CRF+IL-4组。收集细胞,提取总RNA, RT-PCR检测M2型标记物(CD206、dectin-1、IL-10)的mRNA的表达。收集细胞,Western Blotting检测M2型标记物(CD206、dectin-1)蛋白水平的表达。 五、大鼠腹腔巨噬细胞一氧化氮合酶活性(一氧化氮(NO)产量)和精氨酸合酶活性的检测 1、慢性肾衰对大鼠腹腔巨噬细胞一氧化氮合酶活性(NO产量)的影响 提取的Sham组和CRF组大鼠的腹腔巨噬细胞用LPS (1000ng/ml)刺激24小时,分为Sham组,CRF组,Sham+LPS组,CRF+LPS组。收集细胞上清,按试剂盒说明,用Griess reagent方法检测细胞上清中NO的浓度,并以细胞总蛋白矫正。 1、慢性肾衰对大鼠腹腔巨噬细胞精氨酸合酶活性的影响 提取的Sham组和CRF组大鼠的腹腔巨噬细胞用IL-4(100ng/ml)刺激24小时,分为Sham组,CRF组,Sham+IL-4组,CRF+IL-4组。收集细胞,按试剂盒说明,检测精氨酸合酶活性,并以细胞总蛋白矫正。 六、统计方法 所有数据均代表3次以上重复实验的结果,以均数±标准差表示,所有统计分析由统计软件SPSS16.0完成。与常数项比较,采用单样本t检验；方差齐的多个样本均数的比较采用One-Way ANOVA,两两比较采用LSD法；方差不齐的多个样本均数的比较采用Welch法,两两比较采用Dunnett's T3法。p0.05为差异有统计学意义。 第二部分：尿毒症血清对巨噬细胞活化及反应性的影响 一、大鼠正常血清和尿毒症血清的制备 将Sham组和CRF组大鼠分别腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉,仰卧位固定于鼠台上。腹主动脉采血,4℃3000rpm离心10min,抽取上层血清分装,-80℃保存备用。 二、尿毒症血清对正常大鼠腹腔巨噬细胞活化及反应性的影响 1、大鼠腹腔巨噬细胞M1型标记物及对LPS刺激的反应性的检测 正常大鼠腹腔巨噬细胞分别20%的大鼠正常血清和20%大鼠尿毒症血清培养24小时,再用LPS(1000ng/ml)刺激24小时,收集细胞,提取总RNA, real-timePCR检测M1型标记物(TNF-α、IL-6、MCP-1)的mRNA的表达。收集细胞上清,按试剂盒说明,用ELISE方法检测M1型标记物(TNF-α、IL-6、MCP-1)在细胞上清中的浓度,并以细胞总蛋白矫正。 2、大鼠腹腔巨噬细胞M2型标记物及对IL-4刺激的反应性的检测 正常大鼠腹腔巨噬细胞分别20%的大鼠正常血清和20%大鼠尿毒症血清培养24小时,再用IL-4(100ng/ml)刺激24小时,收集细胞,提取总RNA, real-timePCR检测M2型标记物(CD206、dectin-1、IL-10)的mRNA的表达。收集细胞,Western Blotting检测M2型标记物(CD206、dectin-1)蛋白水平的表达。 三、人对照血清和尿毒症血清的制备 尿毒症血清来自本科住院未行血液透析或腹膜透析的患者,且年龄在18～45岁之间,除外糖尿病、系统性红斑狼疮等继发性因素导致的尿毒症,正常人对照组血清采自自愿者和本科住院的单纯血尿患者(肾功能正常、血脂、血压正常),要求年龄与尿毒症相仿。留取全血标本,4℃3000rpm离心10min,抽取上层血清分装,-80℃保存备用。 四、尿毒症血清对人巨噬细胞株活化及反应性的影响 1、THP-1人单核细胞株的培养和诱导分化 THP-1人单核细胞株采用美国ATCC细胞株。复苏后在37℃,5%CO2,20%FBS的RPMI1640培养基中培养,传代。细胞状态良好时接种于培养板,每48小时换一次液,待细胞长至约80-90%,用乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)诱导细胞分化为巨噬细胞。换用不含FBS的DMEM中继续培养,使细胞处于同步生长状态,然后用于实验。 2、人巨噬细胞株M1型标记物及对LPS刺激的反应性的检测 人巨噬细胞株分别20%的人正常血清和20%人尿毒症血清培养24小时,再用LPS (1000ng/ml)刺激24小时,收集细胞,提取总RNA, RT-PCR检测M1型标记物(TNF-α、IL-6、MCP-1)的mRNA的表达。 3、人巨噬细胞株M2型标记物及对IL-4刺激的反应性的检测 人巨噬细胞株分别20%的人正常血清和20%人尿毒症血清培养24小时,再用IL-4(100ng/ml)刺激24小时,收集细胞,提取总RNA, real-time PCR检测M2型标记物(CD206、dectin-1、IL-10)的mRNA的表达。收集细胞,Western Blotting检测M2型标记物(CD206、dectin-1)蛋白水平的表达。 五、统计方法 所有数据均代表3次以上重复实验的结果,以均数±标准差表示,所有统计分析由统计软件SPSS16.0完成。与常数项比较,采用单样本t检验；方差齐的多个样本均数的比较采用One-Way ANOVA,两两比较采用LSD法；方差不齐的多个样本均数的比较采用Welch法,两两比较采用Dunnett's T3法。p0.05为差异有统计学意义。 第三部分、AMPK激动剂(AICAR)对大鼠腹腔巨噬细胞活化的干预作用 一、AICAR对大鼠腹腔巨噬细胞M1型标记物及对LPS刺激的反应性的干预作用的检测 正常大鼠腹腔巨噬细胞用AICAR作用4小时,再分别20%的大鼠正常血清和20%大鼠尿毒症血清培养24小时,最后用LPS(1000ng/ml)刺激24小时,收集细胞,提取总RNA, real-time PCR检测检测M1型标记物(TNF-α、IL-6、 MCP-1)的mRNA的表达。收集细胞上清,按试剂盒说明,用ELISE方法检测M1型标记物(TNF-α、IL-6、MCP-1)在细胞上清中的浓度,并以细胞总蛋白矫正。 二、AICAR对大鼠腹腔巨噬细胞M2型标记物及对IL-4刺激的反应性的干预作用的检测 正常大鼠腹腔巨噬细胞用AICAR作用4小时,再分别20%的大鼠正常血清和20%大鼠尿毒症血清培养24小时,最后用IL-4(100g/ml)刺激24小时,收集细胞,提取总RNA, real-time PCR检测M2型标记物(CD206、dectin-1、IL-10)的mRNA的表达。收集细胞,Western Blotting检测M2型标记物(CD206、dectin-1)蛋白水平的表达。 三、统计方法 所有数据均代表3次以上重复实验的结果,以均数±标准差表示,所有统计分析由统计软件SPSS16.0完成。与常数项比较,采用单样本t检验；方差齐的多个样本均数的比较采用One-Way ANOVA,两两比较采用LSD法；方差不齐的多个样本均数的比较采用Welch法,两两比较采用Dunnett's T3法。p0.05为差异有统计学意义。 结果 第一部分：5/6肾切大鼠腹腔来源巨噬细胞相关实验 一、肾衰大鼠模型的确立 在二步法5/6肾切除术后的第12周,采集大鼠尿液和血液测定血肌酐和肌酐清除率。在第12周时,肾衰组大鼠体重和肌酐清除率与假手术组相比显著减少(p0.05),而血肌酐显著升高(p0.001)。 二、流式细胞术鉴定大鼠腹腔巨噬细胞的纯度 用流式细胞术鉴定大鼠腹腔巨噬细胞的纯度为90.74%,同型对照为1.6%。 三、慢性肾功能不全对正常大鼠腹腔巨噬细胞的活化及反应性的影响 1、慢性肾衰大鼠腹腔来源巨噬细胞易向M1型转化 CRF组大鼠腹腔来源巨噬细胞M1型标记物(TNF-α、IL-6、MCP-1)的mRNA以及蛋白表达与Sham组相比明显增强(p0.05)；且CRF组大鼠腹腔来源巨噬细胞对LPS刺激反应性与Sham组相比明显增强(p0.05), CRF+LPS组M1型标记物(TNF-α、IL-6、MCP-1)的mRNA以及蛋白表达比Sham+LPS组相比明显增强(p0.05)。 2、慢性肾衰大鼠腹腔来源巨噬细胞向M2型转化明显抑制 CRF组大鼠腹腔来源巨噬细胞对IL-4刺激反应性与Sham组相比明显减弱(p0.05), CRF+IL-4组M2型标记物(CD206、dectin-1、IL-10)的mRNA表达比Sham+IL-4组相比明显减弱(p0.05), CRF+IL-4组M2型标记物(CD206、dectin-1)的蛋白表达比Sham+IL-4组相比明显减弱(p0.05)。 四、大鼠腹腔巨噬细胞一氧化氮合酶活性(一氧化氮(NO)产量)和精氨酸合酶活性的检测 1、 CRF组大鼠腹腔来源巨噬细胞一氧化氮合酶活性与Sham组相比明显增强(p0.05)；且CRF组大鼠腹腔来源巨噬细胞对LPS刺激反应性与Sham组相比明显增强(p0.05),CRF+LPS组一氧化氮合酶活性比Sham+LPS组相比明显增强(p0.05)。 2、CRF组大鼠腹腔来源巨噬细胞对IL-4刺激反应性与Sham组相比明显减弱(p0.05), CRF+IL-4组精氨酸合酶活性比Sham+IL-4组相比明显减弱(p0.05)。 结论 慢性肾衰大鼠腹腔来源巨噬细胞易向M1型转化,而向M2型转化明显抑制。 第二部分：尿毒症血清对巨噬细胞活化及反应性的影响 一、尿毒症血清对大鼠腹腔巨噬细胞活化及反应性的影响 1、尿毒症血清作用下大鼠腹腔巨噬细胞易向M1型转化 20%尿毒症血清组巨噬细胞M1型标记物(TNF-α、IL-6、MCP-1)的mRNA以及蛋白表达与20%正常血清组相比明显增强(p0.05)；且20%尿毒症血清组大鼠腹腔来源巨噬细胞对LPS刺激反应性与20%正常血清组相比明显增强(p0.05),20%尿毒症血清+LPS组M1型标记物(TNF-α、IL-6、MCP-1)的mRNA以及蛋白表达比20%正常血清+LPS组相比明显增强(p0.05)。 2、尿毒症血清作用下大鼠腹腔巨噬细胞巨噬细胞向M2型转化明显抑制 20%尿毒症血清组大鼠腹腔巨噬细胞巨噬细胞对IL-4刺激反应性与20%正常血清组相比明显减弱(p0.05),20%尿毒症血清+IL-4组M2型标记物(CD206、dectin-1、IL-10)的mRNA表达比20%正常血清+IL-4组相比明显减弱(p0.05),20%尿毒症血清+IL-4组M2型标记物(CD206、dectin-1)的蛋白表达比20%正常血清+IL-4组相比明显减弱(p0.05)。 二、尿毒症血清对人巨噬细胞株活化及反应性的影响 1、人THP-1细胞用乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)诱导细胞分化为人巨噬细胞株。 1、尿毒症血清作用下人巨噬细胞株易向M1型转化 20%尿毒症血清组人巨噬细胞株M1型标记物(TNF-α、IL-6、MCP-1)的mRNA以及蛋白表达与20%正常血清组相比明显增强(p0.05)；且20%尿毒症血清组人巨噬细胞株对LPS刺激反应性与20%正常血清组相比明显增强(p0.05),20%尿毒症血清+LPS组M1型标记物(TNF-α、IL-6、MCP-1)的mRNA以及蛋白表达比20%正常血清+LPS组相比明显增强(p0.05)。 2、尿毒症血清作用下人巨噬细胞株向M2型转化明显抑制 20%尿毒症血清组人巨噬细胞株对IL-4刺激反应性与20%正常血清组相比明显减弱(p0.05),20%尿毒症血清+IL-4组M2型标记物(CD206、dectin-1、IL-10)的mRNA表达比20%正常血清+IL-4组相比明显减弱(p0.05),20%尿毒症血清+IL-4组M2型标记物(CD206、dectin-1)的蛋白表达比20%正常血清+IL-4组相比明显减弱(p0.05)。 结论 尿毒症血清作用下巨噬细胞易向M1型转化,而向M2型转化明显抑制。 第三部分：AMPK激动剂(AICAR)对大鼠腹腔巨噬细胞活化的干预作用 一、20%尿毒症血清+AICAR+LPS组M1型标记物(TNF-α、IL-6、MCP-1)的mRNA以及蛋白表达与20%尿毒症血清+LPS组相比明显减弱(p0.05)。 二、20%尿毒症血清+AICAR+IL-4组M2型标记物(CD206、dectin-1、IL-10)的mRNA表达比20%尿毒症血清+IL-4组相比明显减弱(p0.05),20%尿毒症血清+AICAR+IL-4组M2型标记物(CD206、dectin-1)的蛋白表达比20%尿毒症血清+IL-4组相比明显增强(p0.05)。 结论 AMPK激动剂(AICAR)可逆转尿毒症血清对巨噬细胞向M1型转化的促进和M2型转化抑制的作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R692

【共引文献】

相关期刊论文 前10条

1 孙真;贾生美;冯祥汝;陈义龙;翟新新;沈雪飞;张俊辉;王文东;杨振国;卢强;;鲤鱼外周血白细胞TLR5M全长cDNA克隆及序列分析[J];中国畜牧兽医;2013年09期

2 邵小娟;张艳梅;魏艳玲;樊丽琳;刘卉;杨均;邢寒阳;崔红莉;颜綦先;唐雯;孙文静;陈东风;;NASH患者脂肪组织巨噬细胞计数的变化[J];实用肝脏病杂志;2013年06期

3 李莹;张兴毅;;TLR4与脑血管神经疾病的研究进展(综述)[J];安徽卫生职业技术学院学报;2013年06期

4 Ling Zhang;Cheng-Cai Wang;;Inflammatory response of macrophages in infection[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2014年02期

5 朱小虎;刘兰;黄杨;;超声心动图评价心外膜脂肪组织与2型糖尿病并发冠心病的相关性[J];成都医学院学报;2014年02期

6 倪宇;杨垒;杨亦彬;;遵义市县级居民慢性肾脏病知晓率调查分析[J];贵州医药;2014年05期

7 武晓春;方奕;;119例合并高血压的中重度慢性肾脏病患者心脏彩超评价心脏结构和功能的临床研究[J];中国中西医结合肾病杂志;2013年10期

8 赵亚;车树强;徐英;;慢性肾衰竭微炎症状态的研究进展[J];湖南中医杂志;2013年12期

9 孙响波;于妮娜;张法荣;;慢性肾衰竭微炎症状态与细胞因子相关性探讨[J];湖南中医杂志;2013年10期

10 张天凤;王大新;;高密度脂蛋白胆固醇亚型抗动脉粥样硬化的研究进展[J];临床心血管病杂志;2014年06期

相关博士学位论文 前6条

1 赵敏;高脂饮食对大鼠肝脏内质网应激和炎症的影响及低脂膳食干预效果研究[D];华中科技大学;2013年

2 黎黎;替米沙坦激活过氧化物酶体增殖物活化受体δ改善小鼠胰岛素抵抗及其机制研究[D];第三军医大学;2013年

3 戴菱菱;巨噬细胞的替代激活抑制脂毒性引起的巨噬细胞死亡[D];中南大学;2013年

4 历志;Notch信号调控巨噬细胞参与心梗重塑的作用和分子机制研究[D];第四军医大学;2013年

5 赵敏;高脂饮食对大鼠肝脏内质网应激和炎症的影响及低脂膳食干预效果研究[D];华中科技大学;2013年

6 苏莎莎;Mir-10b调节K1f4介导的巨噬细胞极化并抑制T_H1T_H17细胞反应[D];南方医科大学;2014年

相关硕士学位论文 前10条

1 徐小云;氨基末端B型脑钠肽前体在急性呼吸窘迫综合征的应用价值探讨[D];广西医科大学;2013年

2 赵琼;TLR-1，TLR-2在大鼠呼吸机相关性肺损伤肺组织中的表达及其作用的实验研究[D];广西医科大学;2013年

3 黄霞梅;Toll样受体基因多态性与HBV相关性肝炎、肝硬化、肝癌的遗传易感性研究[D];广西医科大学;2013年

4 陈瑞敏;冠脉病变程度与肾小球滤过率的相关性分析[D];大连医科大学;2012年

5 邵小娟;皮下及网膜脂肪组织巨噬细胞表型转换在NAFLD发生过程中的作用[D];第三军医大学;2013年

6 彭艳;香烟烟雾诱导的慢性阻塞性肺疾病大鼠模型肺组织中Derlin-1的表达[D];南华大学;2013年

7 廖碧红;不同剂量瑞舒伐他汀在ACS患者PCI围手术期的疗效比较[D];暨南大学;2013年

8 陈玉玲;慢性肾衰大鼠脂肪组织RAS活化对脂肪组织巨噬细胞表型改变的影响及机制[D];南方医科大学;2013年

9 李江;糖尿病肾病进展的探讨[D];重庆医科大学;2013年

10 李国照;益气温阳活血利水方治疗慢性充血性心力衰竭及对NT-ProBNP影响的临床研究[D];山东中医药大学;2013年

，

本文编号：1975048