肥大细胞在类风湿关节炎中的作用

发布时间：2018-06-12 06:01

本文选题：骨髓源性肥大细胞 + Ⅱ型胶原　；参考：《南方医科大学》2014年硕士论文

【摘要】：第一部分骨髓源性肥大细胞对软骨细胞表达Ⅱ型胶原以及糖胺多糖(GAG)的影响研究背景类风湿关节炎(RA)是一种病因不明的慢性系统性自身免疫性疾病,关节软骨和骨的破坏是其主要的病理基础[1],世界范围内RA年发病率约为3/10000,总患病率约为1%。近十年来,RA的治疗发展迅速,联合使用抗风湿药物及新的生物制剂使疗效明显改善,如英夫利昔单抗、依那西普、Abatacept、阿那白滞素、Tocilizumab等。其中抗TNF-α是治疗RA和脊柱关节病的一个重要进展,但循证医学研究发现仍有30-40%患者症状得不到明显改善或根本无效[2],其它如抗IL-1或IL-6单克隆抗体疗效则更差,说明除TNF-α、IL-1、IL-6等细胞因子外,还有其他机制参与RA的发病。肥大细胞及其相关细胞因子在RA发病机制中的作用是近年来的研究热点之一,肥大细胞约占正常关节滑膜细胞总数的3%,其功能可能是参与修复损伤或清除病原体。有研究表明,在正常关节中,活化的肥大细胞数仅占其总数1%-5%,但在RA患者的滑膜中,活化的肥大细胞数高达10%-15%。滑膜肥大细胞常聚集于血管翳和软骨交接及血管翳侵入骨皮质处[3],通过多种途径在RA中发挥致病作用,导致软骨和骨的损害。滑膜肥大细胞可与其它细胞相互作用,促使血管渗透性增加、激活滑膜细胞、促进血管增生、参与基质的重塑等继而导致软骨和骨的破坏,滑膜肥大细胞可能通过产生大量碱性成纤维细胞生长因子、白三烯C4和血小板源性生长因子等调节因子促使成纤维样细胞增殖[4],并可调节成纤维样细胞的促炎性活性,如促使成纤维细胞表达组织蛋白酶、基质金属蛋白酶等效应分子,导致软骨和骨的破坏。除此之外,滑膜肥大细胞还分泌多种细胞因子参与RA的发病,如TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-5和IL-6等。类风湿关节炎的一大病理特征就是关节软骨的破坏,其细胞学基础是软骨细胞外基质的降解。软骨细胞外基质的两大主要成份是Ⅱ型胶原与蛋白聚糖[5],占正常关节软骨干重的90%左右。蛋白聚糖含有很多成分,其中GAG是其主要成分之一,Ⅱ型胶原和其他胶原成分构成关节软骨的网状骨架,蛋白聚糖和透明质酸相互交联形成毛刷样结构,将软骨深埋在其中。关节软骨的Ⅱ型胶原和蛋白聚糖使关节软骨具有很好的弹性和抗压性[6],Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的丢失和降解,导致关节软骨的弹性丧失,最终导致关节软骨的损害。因此,我们实验主要从肥大细胞对软骨细胞表达Ⅱ型胶原和GAG的影响入手来研究肥大细胞与关节软骨破坏之间的关系,从而为RA的治疗探寻一个新的靶点。研究方法一、实验分组原代培养小鼠骨髓源性的肥大细胞(BMMCs)和关节软骨细胞共培养,分为4个组：软骨细胞组(对照组)、软骨细胞+BMMCs组(BMMCs组)、软骨细胞+BMMCs+色甘酸二钠组(DSCG组)、软骨细胞+BMMCs+Compound48/80组(C48/80组),每组设3个复孔,两个时间点24h与48h。二、原代培养小鼠骨髓源性的肥大细胞 (1)将1只5周龄雌性C57BL/6小鼠处死,置于75%酒精中消毒3分钟。 (2)剪开小鼠后肢皮肤,取下后肢的股骨,置于含3ml15%胎牛血清RPMI-1640的中皿中,在体视镜下剔除股骨上的肌肉组织和结缔组织修,然后超净台上剪断股骨两端。 (3)用lml注射器将骨髓冲洗出来,直至骨髓腔变成白色,将细胞吹匀后加入RPMI-1640培养液进行培养,并加入重组小鼠IL-3和SCF各10μg/ml,培养3日后初次换液,随后可4-7日换液一次,培养4-6周后基本都为肥大细胞。三、原代培养小鼠关节软骨细胞 (1)将2只5周龄雌性C57BL/6小鼠颈椎脱臼处死后,置于75%酒精中消毒3分钟。 (2)剪开小鼠后肢皮肤,将后肢整个分离,置于不含血清DMEM的平皿中。 (3)在体视镜下分离股骨头软骨帽、腓骨软骨带和胫骨软骨帽,修剪软骨附带的滑膜组织和结缔组织,剪成1mm3以下碎块,0.25%胰酶在37℃振荡(200次/分)消化30分钟,PBS清洗2次,加入0.3%的Ⅳ型胶原酶,在37℃孵箱中振荡消化(200次6/分)1小时,300g离心取上清。 (4)在超净台上加入培养液后进行培养,3日后初次换液,随后可5-7日换液一次。待培养细胞达80%以上时,胰酶消化细胞,按1：2-3传代。四、各组软骨细胞内II型胶原的表达对照组、BMMCs、DSCG组以及C48/80组每孔加入200μl裂解液,冰上裂解30min,将细胞裂解液转移到1.5ml EP管中,14000转离心取上清,即为各组软骨细胞内的总蛋白。一部分煮沸,Western Blotting检测各组软骨细胞的内II型胶原的表达,一部分直接用ELISA检测软骨细胞内II型胶原的表达。五、各组软骨细胞内糖胺多糖(GAG)的测定对照组、BMMCs组、DSCG组以及C48/80组每孔加入200μl裂解液,冰上裂解30min,将细胞裂解液转移到1.5ml EP管中,14000转离心取上清,既为各组软骨细胞内的总蛋白,用1,9-二甲基亚甲蓝法(DBM PH=3.0,16mg/L)绘制硫酸软骨素标准曲线以及测量计算各组软骨细胞的GAG浓度。六、统计方法数据用SPSS13.0for windows统计软件处理,以均数±标准差表示,方差齐的多样本均数的比较采用One-Way ANOVA,两两比较采用LSD法；方差不齐的多个样本均数的比较采用Welch法,两两比较采用Dunnett's T3法。P0.05为差异有统计学意义。结果一、骨髓源性的肥大细胞的培养骨髓源性的肥大细胞培养四周后,用流式细胞仪检测其表面CD117的表达,培养四周的骨髓源性的肥大细胞纯度为94%。二、小鼠关节软骨细胞的原代培养分离的原代软骨细胞生长一周后呈典型铺路石样改变,甲苯胺蓝染色后软骨细胞呈紫红色,软骨细胞的阿利新蓝染色可见细胞被蓝染。三、各组软骨细胞内的Ⅱ型胶原的ELISA以及Western Blotting检测在共培养24以及48小时点,BMMCs组以及DSCG组软骨细胞内的Ⅱ型胶原与对照组间无差异(p0.05),C48/80组软骨细胞的II型胶原相对于正常组以及BMMCs组显著降低(p0.01),Western Blotting检测的趋势与ELISA检测的趋势一致。四、各组软骨细胞内的糖胺多糖(GAG)的检测在共培养24以及48小时点,BMMCs组以及DSCG组软骨细胞内的GAG与对照组间无差异(p0.05),C48/80组软骨细胞的GAG相对于正常组以及BMMCs组显著降低(p0.01) 结论 C48/80激活的骨髓源性肥大细胞可降低软骨细胞内的II型胶原以及糖胺多糖(GAG)的表达。第二部分在胶原抗体诱导关节炎(CAIA)模型中,肥大细胞对Cathepsin S表达的影响研究背景肥大细胞是一类广泛分布于全身组织和器官的非特异性免疫细胞,既往研究多在肥大细胞参与急性过敏反应。2002年,通过动物实验发现关节炎的发生依赖肥大细胞的存在,确认了肥大细胞在免疫复合物介导的关节炎中起关键作用特别是参与了RA的发病过程[7-8],但是肥大细胞如何参与RA的发病,目前还不完全清楚。组织蛋白酶S是属于木瓜蛋白酶超家族的一种半胱氨酸蛋白酶,在抗原提呈细胞上高表达如树突状细胞、B细胞、巨噬细胞等,它对多种蛋白具有催化活性,特别是MHC Ⅱ恒定链和细胞外基质成分。已经证实组织蛋白酶S参与多种疾病,如动脉粥样硬化、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肿瘤、骨关节炎等疾病。目前,组织蛋白酶S在RA中的作用研究较少,既往有研究证实,组织蛋白酶S敲除的小鼠,对胶原诱导关节炎的敏感性显著降低,在RA的滑液中,组织蛋白酶S水平可显著升高,提示组织蛋白酶S可能参与RA的致病。既往有研究证实,在组织蛋白酶S高表达的过敏性皮炎小鼠中,肥大细胞在皮肤损害区异常增多；在腹主动脉瘤小鼠模型中,肥大细胞mMCP-4缺失的小鼠,组织蛋白酶S表达显著降低,这些研究均提示,肥大细胞可能通过调节或分泌组织蛋白酶S参与疾病的发展过程。胶原抗体诱导的关节炎(CAIA)是一种简单的研究类风湿性关节炎模型,可用于RA致病机制研究和筛选候选治疗药物。CAIA模型的关节炎是由一组针对Ⅱ型胶原的单克隆抗体复合物诱导而成,随后用LPS刺激小鼠,可以减少Ⅱ型胶原的单克隆抗体复合物的用量[9]。CAIA与经典的胶原诱导的关节炎(CIA)模型相比有很多优势,比如CAIA发病快速,吸收速率高,并且可在转基因小鼠和基因缺陷小鼠上使用,造模型所需要时间短,只需要1-2个星期。CIA模型不能用于转基因小鼠和基因缺陷小鼠,造模时间长,需要2到3个月。CAIA模型与人类类风湿关节炎的致病特点有惊人的相似性,包括：关节炎、滑膜炎、多形核细胞与单核细胞浸润、血管翳形成、软骨基质降解和骨损害,CAIA模型是经典CIA模型的延续,已经广泛的应用于小鼠、大鼠等动物。因此,本实验选用胶原抗体诱导的关节炎(CAIA)模型,在CAIA模型中观察肥大细胞对组织蛋白酶S表达的影响,探索肥大细胞在RA中可能的致病机制。实验方法一、实验分组实验分为：对照组、CAIA模型组、CAIA模型+DSCG组(色甘酸钠二钠一种肥大细胞的稳定剂腹腔注射25mg/kg/d)、CAIA模型+C48/80组(Compound48/80一种肥大细胞的激活剂腹腔注射4mg/kg/d) 二、各组胶原抗体诱导的关节炎(CAIA)模型的建立 CAIA模型组：Day0给小鼠尾静脉注射150μl (1.5mg)抗II型胶原的5种单克隆抗体复合物,Day3给小鼠腹腔注射70μl (35μg)脂多糖(LPS); CAIA模型+C48/80组：同CAIA模型组,此外每天给小鼠腹腔注射C48/804mg/kg/d; CAIA模型+DSCG组：同CAIA模型组,此外每天给小鼠腹腔注射予DSCG25mg/kg/d;对照组(control):Day0给小鼠尾静脉注射150μl0.9%生理盐水,Day3给小鼠腹腔注射70μl0.9%生理盐水。三、各组小鼠的关节评分评分标准：0分：正常；1分：腕或踝关节的轻度红肿；2分：腕或踝关节中度红肿；3分：严重肿胀包括足趾、足、脚踝；4分：最大炎症。四、各组的肺组织、踝关节的留取 (1)给小鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉,仰卧固定在鼠台上,打开胸腔。灌胃针从左心室穿刺入主动脉,同时剪开右心耳,4℃预冷的生理盐水(含肝素20U/ml)200ml快速冲洗,可看到肝脏、肺组织和肌肉等快速变苍白,右心耳流出液体无色清亮表明灌注充分。 (2)立即摘取肺、踝关节,再次用冰盐水冲洗后,置于4%的多聚甲醛液内,4℃后固定24h。肺组织经纯水漂洗2h后,梯度酒精脱水,二甲苯透明,浸蜡包埋,踝关节用10%的EDTA中性脱钙液脱钙后,再用纯水漂洗2h后,梯度酒精脱水,二甲苯透明,浸蜡包埋。五、各组小鼠踝关节以及肺组织的HE染色六、免疫组化检测各组小鼠踝关节以及肺组织的肥大细胞的CD117以及组织蛋白酶S的表达七、统计方法数据用SPSS13.0for windows统计软件处理,所有数据以均数±标准差表示,方差齐的多样本均数的比较采用One-Way ANOVA,两两比较采用LSD法；方差不齐的多个样本均数的比较采用Welch法,两两比较采用Dunnett's T3法。P0.05为差异有统计学意义。结果一、各组小鼠的关节评分注射抗体和LPS后,对照组与CAIA模型+DSCG组的关节评分一直为0,CAIA模型+C48/80组与模型组关节评分在第4到5天开始出现,第8到9天达到高峰,第10到14天逐渐下降,但CAIA模型+C48/80组的关节评分显著高于其他三组,在第8天到14天之间,CAIA模型+C48/80组的关节评分与其他三组相比均有显著性差异(p0.05),其他三组间的关节评分没有差异。二、踝关节以及肺组织的HE染色 CAIA模型组、CAIA模型+DSCG组以及CAIA模型+C48/80组的踝关节HE染色可见不同程度的滑膜增生,软骨以及骨的破坏,且CAIA模型+C48/80组的滑膜增生,软骨以及骨的破坏的程度较其他两组明显增加,四组小鼠的肺组织的HE染色均未见明显变化。三、踝关节以及肺组织的CD117免疫组化染色 CAIA模型组踝关节以及肺组织的肥大细胞的CD117的表达与CAIA模型+DSCG组以及对照组相比均显著增高(p0.05),CAIA模型+C48/80组踝关节的肥大细胞的CD117的表达与其他三组相比均显著增高(p0.05)。四、踝关节的组织蛋白酶S的免疫组化染色 CAIA模型组踝关节的组织蛋白酶S的表达与CAIA模型+DSCG组以及对照组相比均显著增高(p0.05),CAIA模型+C48/80组踝关节的组织蛋白S的表达与其他三组相比均显著增高(p0.05)。结论肥大细胞可能通过调节或分泌组织蛋白酶S参与CAIA模型的关节损害
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R593.22

【参考文献】