Draxin在小鼠脊髓损伤修复过程中的表达变化及其表达位置的实验研究

发布时间：2018-06-14 09:13

  本文选题：Draxin + DCC　； 参考：《河北医科大学》2014年硕士论文

【摘要】：目的： 成功建立脊髓背侧半横切模型，观察轴突生长导向因子draxin在脊髓损伤不同时期的表达变化及其在损伤脊髓中的表达位置，为其在临床脊髓损伤疾病中的应用提供实验依据。 方法： 1动物及分组：2月龄体重约35g小鼠100只，按背侧脊髓半横切方式建立脊髓损伤模型，根据Reuter感觉功能评价方法，确定脊髓损伤背侧半横切模型建立成功。脊髓损伤模型随机分为正常未损伤组、损伤1天组、损伤2天组、损伤3天组、损伤4天组、损伤5天组、损伤6天组和损伤7天组，各10只,分别用于RT-PCR和Western Blot检测。其余损伤小鼠模型分成损伤1天组、损伤2天组、损伤3天组、损伤5天组，各5只，用于损伤后脊髓组织免疫组织化学抗draxin抗体染色观察，或用于免疫组织化学抗draxin抗体、抗DCC抗体双染观察。 2mRNA提取及RT-PCR：正常未损伤组、损伤1天组、损伤2天组、损伤3天组、损伤4天组、损伤5天组、损伤6天组和损伤7天组每组各取5只，10%水合氯醛麻醉后冰上迅速取下损伤节段脊髓，去除椎骨，暴露脊髓组织，DEPC水配制的PBS清洗后，将组织迅速转移至Trizol中，常规提取mRNA，用NanoDrop2000C进行定量，反转录成cDNA，-20℃保存，用于PCR。 3蛋白提取及Western Blot：正常未损伤组、损伤1天组、损伤2天组、损伤3天组、损伤4天组、损伤5天组、损伤6天组和损伤7天组每组各取5只，10%水合氯醛麻醉后冰上迅速取下损伤节段脊髓，去除椎骨，暴露脊髓组织，普通PBS清洗后迅速转移至裂解液中，充分匀浆后于冰上静置30min，12000rpm，4℃离心20min，取上清弃沉淀，小部分上清液用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，其余部分上清液置于-80℃冰箱储存，用于Western Blot检测。 4组织制备及免疫组织化学染色观察：损伤1天组、损伤2天组、损伤3天组、损伤5天组，每组各取5只。将小鼠麻醉并暴露心脏，将输液针刺入左心室，同时用剪刀挑开右心耳，迅速生理盐水冲洗，至无血后，用4%多聚甲醛进行灌注。取损伤节段脊髓组织，PBS清洗干净，冷4%多聚甲醛固定2h，放入含30%蔗糖的PBS中充分沉降，取出组织OCT包埋，-80℃保存，用于免疫组织化学染色。 结果： 1成年期小鼠脊髓损伤后不同时期draxin mRNA的表达变化 成年期小鼠draxin mRNA在无损伤正常脊髓、损伤后1天、损伤后2天、损伤后3天、损伤后4天、损伤后5天、损伤后6天、损伤后7天的脊髓组织中均有表达。随着时间的推移逐渐增高，损伤后第3天出现了一个表达高峰，后又表达下降。IOD数值在不同的检测时段有显著的差异(P＜0.05)，组间两两比较，，损伤后3天与其他组有显著的差异（P＜0.05），有统计学意义。 2成年期小鼠脊髓损伤后不同时期draxin蛋白的表达变化 成年期小鼠draxin蛋白在无损伤正常脊髓、损伤后1天、损伤后2天、损伤后3天、损伤后4天、损伤后5天、损伤后6天、损伤后7天的脊髓组织中均有表达。随着时间的推移draxin蛋白的表达逐渐增高，并在损伤后第3-5天出现了一个表达高峰，后其表达又有所下降。IOD数值在不同的检测时段有显著的差异(P＜0.05)，组间两两比较，损伤后3-5天与其他组有显著的差异（P＜0.05），有统计学意义。 3Draxin蛋白在成年期小鼠损伤脊髓中的表达位置及其变化 Draxin阳性区域，荧光染色呈红色。Draxin红色信号集中于损伤切口的周边。并且在损伤后1天、损伤后2天、损伤后3天、损伤后5天不同时间阶段，表达量呈损伤后1到5天逐渐增多趋势，表达高峰集中于损伤后3-5天。 4Draxin受体DCC在成年期小鼠损伤脊髓中的表达 DCC为draxin受体之一。Draxin阳性区域，荧光染色呈红色；DCC阳性区域，荧光染色呈绿色。Draxin红色信号和DCC绿色信号表达位置都集中于切口周边，且draxin蛋白与DCC蛋白表达位置一致，图中呈暗黄色区域。 结论： 1Draxin mRNA和draxin蛋白在成年期小鼠正常脊髓组织中表达，表达含量微少，损伤后被诱导增多。 2在成年期小鼠脊髓损伤的不同时间阶段，draxin的表达量不同，脊髓损伤后1-7天的不同时间内，出现了draxin mRNA和draxin蛋白损伤后3-5天的表达高峰。 3Draxin蛋白在成年期小鼠损伤的脊髓中被诱导增多，且表达集中于损伤切口周边，并且在损伤后1-5天的不同时间内，呈现损伤后1天、损伤后2天、损伤后3天、损伤后5天表达量逐渐增多趋势。 4DCC为draxin的受体之一，在成年期小鼠损伤脊髓中表达增多，且集中表达于损伤切口周边，与draxin蛋白表达位置一致。
[Abstract]:Objective:
A semi transection model of the dorsal spinal cord was successfully established to observe the changes in the expression of axon growth guiding factor draxin in different periods of spinal cord injury and its expression in the injured spinal cord, providing an experimental basis for its application in the clinical spinal cord injury.
Method锛

本文编号：2016864