miR-22在主动脉夹层发病机制中的作用及调控机制研究

发布时间：2018-06-24 18:38

  本文选题：主动脉夹层 + miR-22　； 参考：《第二军医大学》2016年博士论文

【摘要】：研究目的:明确miR-22对血管平滑肌细胞作用及其在主动脉夹层发病中的作用及调控机制。研究方法:1.在符合伦理要求前提下,收集正常捐献者主动脉组织8例,主动脉夹层患者主动脉10例;提取主动脉组织总RNA进行qRT-PCR检测miR-22表达含量;主动脉组织冰冻包埋切片,通过miRNA荧光原位杂交和细胞免疫荧光共定位检测miR-22在主动脉组织中分布差异;2.转基因Tg(Flik1∶egfp)斑马鱼系胚胎单细胞时期显微注射MO-22,于注射后斑马鱼20phf、24phf、30phf收集斑马鱼胚胎各20枚提取总RNA,qRT-PCR检测miR-22表达变化;分别于斑马鱼24phf、30phf在荧光显微镜下观察斑马鱼节间血管及背动脉生长情况;3.构建miR-22上调和下调腺病毒,GCP观察法确定腺病毒转染最佳MOI值,腺病毒转染HASMC48小时后,提取HASMC总RNA,qRT-PCR检测miR-22表达变化;miR-22上调和下调腺病毒转染HASMC,于转染后0h、12h、24h、36h、48h用CCK-8法检测HASMC增殖变化,转染后36h显微镜下拍照计数,统计HASMC增殖;miR-22上调和下调腺病毒转染HASMC48小时后利用annexin V-APC及7-AAD双染色后流式细胞仪检测HASMC凋亡;利用生物信息学软件预测miR-22靶基因;分别提取正常捐献者与主动脉夹层患者主动脉组织总蛋白,miR-22上调和下调腺病毒转染HASMC 72小时后提取细胞总蛋白,Western blot检测miR-22预测MAPK14表达变化;si RNA沉默MAPK14的表达,MAPK14 si RNA与Anti-miR-22共同转染HASMC,annexin V-APC及7-AAD双染色后流式细胞仪检测HASMC凋亡,与对照组比较MAPK14和Anti-miR-22对HASMC凋亡的作用;4.3周龄FVB小鼠普通饮食喂养,饮用水中添加β-氨基丙腈1g/kg/day,2周后,尾静脉注射miR-22 Agomir/antagomir15OD/只,持续喂养至小鼠7周龄时,局麻下小鼠背部皮下植入血管紧张素Ⅱ微泵(1μg/kg/min)24小时,小鼠注射大剂量苯巴比妥麻醉后处死,解剖分离主动脉根部至髂总动脉小鼠主动脉,大体标本观察统计小鼠主动脉夹层发生率,主动脉分为3段,10%福尔马林固定石蜡包埋切片,分别提取RNA、蛋白;通过qRT-PCR检测miR-22表达含量;Western blot检测MAPK14表达变化;小鼠主动脉石蜡切片HE染色测量小鼠主动脉中膜厚度(MT)、管腔直径(LD),计算MT/LD;EVG染色比较小鼠主动脉弹力纤维变化,Masson染色检测小鼠主动脉胶原纤维变化。结果:1.qRT-PCR验证了miR-22在主动脉夹层患者主动脉组织中含量表达下调(P0.05),通过荧光原位杂交及主动脉细胞共定位,发现miR-22在主动脉夹层患者主动脉平滑肌细胞中表达显著下调;2.通过对转基因Tg(Flik1∶egfp)斑马鱼系胚胎单细胞时期显微注射MO-22,发现MO-22可使斑马鱼20-30phf时间内miR-22表达下调(P0.05);miR-22下调可显著抑制斑马鱼24phf节间血管的生长,在斑马鱼30phf时MO-22可显著抑制斑马鱼背动脉的生长;3.Ad-miR-22和Anti-miR-22转染HASMC的最佳MOI值为100;Anti-miR-22转染HASMC 36h后可抑制HASMC的增殖,Ad-miR-22在转染HASMC 36h时可促进HASMC的增殖;Anti-miR-22较其对照组相比促进HASMC的凋亡,差异均具有统计学意义(P0.05);生物信息学预测MAPK14是miR-22的潜在靶基因,通过提取人主动脉夹层患者主动脉组织和HASMC蛋白进行Western blot证明MAPK14符合miR-22的靶基因生物学功能,与miR-22在主动脉夹层患者主动脉组织中的表达相反,MAPK14在主动脉夹层患者组织中表达上调,且在HASMC中,Ad-miR-22可使MAPK14表达下调,Anti-miR-22则促进MAPK14的表达;通过双荧光素酶报告基因系统直接证实MAPK14是miR-22的靶基因;利用si RNA沉默HASMC MAPK14的表达,同时通过腺病毒抑制HASMC中miR-22的表达,发现HASMC的凋亡受到显著抑制;4.通过qRT-PCR证明Ago-miR-22可显著促进小鼠主动脉miR-22的表达,Antago-miR-22较对照组相比抑制小鼠主动脉miR-22的表达(P0.05);收集小鼠主动脉提取组织总蛋白,Western blot证明Ago-miR-22组小鼠主动脉MAPK14表达上调,而Antago-miR-22组小鼠主动脉组织MAPK14表达下调。通过对小鼠主动脉解剖进行大体标本观察统计,夹层造模组、agomir-22组、agomir NC组5/18(27.8%),antagomir-22组、antagomir NC组小鼠主动脉夹层发生率分别为6/18(33.3%)、12/18(66.7%)、11/17(64.7%)、7/18(38.9%),经统计分析,agomir-22组较其对照组相比可显著抑制小鼠主动脉夹层的发生(P0.05),antagomir-22组较其对照组相比主动脉夹层发生无统计学差异(P=0.1267);夹层造模组、agomir-22组、agomir NC组、antagomir-22组、antagomir NC组五组的中膜厚度值分别是74.76±4.59μm、118.94±5.76μm、81.23±3.05μm、65.59±3.74μm、94.76±4.02μm;主动脉管腔直径分别是2.54±0.21mm、1.55±0.11mm、3.12±0.2mm、3.74±0.2mm、1.55±0.11mm、2.94±0.14mm;miR-22上调可使小鼠主动脉MT增大,LD降低,MT/LD增大,而miR-22下调使小鼠主动脉MT降低,LD增大,MT/LD降低;agomir-22组较对照相比增加小鼠主动脉弹力纤维,antagomir-22组较对照组相比使小鼠主动脉弹力纤维减少,结构紊乱,甚至断裂;miR-22上调可增加小鼠主动脉胶原纤维,而miR-22下调导致小鼠主动脉中外膜胶原纤维降低。结论:1.miR-22在主动脉夹层患者主动脉平滑肌细胞中表达显著下调;2.MO-22可显著抑制斑马鱼24phf节间血管生长并抑制30phf斑马鱼背动脉生长;3.Anti-miR-22抑制HASMC增殖,Ad-miR-22可促进HASMC增殖,Anti-miR-22通过上调miR-22靶基因MAPK14的表达促进HASMC凋亡;4.MAPK14在小鼠主动脉miR-22上调组中表达升高,而在miR-22下调组小鼠主动脉中表达降低;miR-22可显著抑制小鼠主动脉夹层的发生,miR-22升高小鼠主动脉MT/LD,增加弹力纤维及胶原纤维使小鼠主动脉中膜结构增强而抑制主动脉夹层发生;而miR-22下调则使小鼠主动脉miR-22下调通过降低主动脉MT/LD,减少并破坏弹力纤维结构,降低胶原纤维含量使主动脉管壁结构薄弱,进而导致主动脉夹层的发生。
[Abstract]:The effects of miR - 22 on vascular smooth muscle cells and the role of miR - 22 in the pathogenesis of aortic dissection were studied . The expression of miR - 22 in aortic dissection was regulated by Western blot . The results showed that the expression of miR - 22 in aortic dissection was downregulated by Western blot ( P0.05 ) . 鍙戠幇HASMC鐨勫噵浜″彈鍒版樉钁楁姂鍒，

本文编号：2062538