【摘要】：研究背景 神经生长因子(nerve growth factor, NGF)作为最早被发现的神经营养因子,在中枢及周围神经元的生长、发育、存活等重要生物学过程中均发挥着举足轻重的作用。发育中的交感和感觉神经元的存活、轴突生长和靶器官支配都依赖于NGF的调控。NGF与两种不同的细胞膜表面受体结合：低亲和性P75受体和它的高亲和性受体酪氨酸激酶TrkA (tyrosine kinase receptor)。而NGF的生物学功能主要依赖TrkA受体来执行。NGF与分布于细胞膜表面的TrkA受体结合,引起TrkA受体的二聚化和酪氨酸自磷酸化,从而激活下游的一系列信号分子从而实现神经营养信号的传递。 因此,NGF生物学功能发挥的前提是其受体TrkA在细胞膜表面的分布。目前研究认为TrkA受体膜表面的水平主要受两条相反的运输通路的调节：其一是TrkA受体合成后向细胞膜表面运输途径；其二是细胞膜表面的TrkA以囊泡形式进入胞质的内吞途径。因此,TrkA受体细胞膜表面的分布水平是以上两个过程综合叠加的结果。目前对于TrkA受体内吞过程的研究是比较多的,但对TrkA经合成途径向细胞膜表面转运的调控机制的研究还比较少。我们想要探讨的问题就是TrkA胞内运输尤其是由合成途径运输的调控机制。 TrkA受体的胞内域是其胞内运输的重要影响因素。本实验室的前期工作中,以TrkA的胞内域为诱饵,通过酵母双杂交方法对大鼠背根神经节cDNA文库进行筛选得到多个与之结合的分子,其中我们感兴趣的为syntaxin8(STX8)。STX8属于可溶性NSF附着蛋白受体(SNARE)家族syntaxin亚家族成员之一,而SNARE家族成员在介导胞内囊泡的运输和膜融合中发挥着重要的作用。文献报道syntaxin家族成员可以参与调节多种膜蛋白受体的转运,比如syntaxin16参与调节囊性纤维化跨膜转导调节器(CFTR)的再循环及膜表面水平；syntaxin6参与调节血管内皮生长因子受体VEGFR2高尔基相关的转运及其膜表面水平与相应的生物学功能。而STX8主要定位于高尔基体、早期内体和晚期内体的膜组分中,并在囊泡的运输和膜融合过程中发挥重要的调节作用。有研究表明位于靶膜上的STX8与STX7、vti1b/vti1a及位于囊泡膜上的VAMP7NAMP8形成复合物促进晚期内体之间的同源融合以及晚期内体与溶酶体的融合。此外STX8被认为能够调控CFTR这种氯离子通道蛋白的细胞膜表面分布,并影响细胞膜CFTR介导的氯离子电流的强度。 总之,STX8能够调节蛋白的运输及相应的功能,而它又能与TrkA受体结合,那么STX8是否参与调控TrkA的胞内运输呢?本研究旨在探讨STX8对TrkA受体胞内运输及生物功能调控作用的研究,这不仅有助于我们深入认识TrkA膜表面水平及功能的调节机制,也能为今后临床应用NGF治疗神经精神疾病提供指导。 研究目的 1.探讨STX8是否与TrkA具有相互作用,是否调节TrkA的转运进而影响TrkA受体的膜表面水平。如影响,是通过对哪条途径的调节来实现的。 2.检测STX8对TrkA和TrkB受体的作用是否一致。 3.探讨STX8是否影响NGF引起的后续信号通路及其介导的生物学功能。 研究方法 1.大鼠背根神经节(DRG)神经元的培养与转染 新生Wistar大鼠,乙醚麻醉后,心脏放血。于超净工作台中依次取出脊髓两侧的背根神经节组织。将所有神经节组织置于已预热消化液(胶原酶1mg/ml及DNA酶0.1mg/ml)37℃消化约15分钟,静置后去除上清,置换消化液(0.25%胰酶-EDTA, DNA酶0.1mg/ml),37℃消化约20分钟,期间间断性摇匀。终止消化后将组织轻轻吹打分散为单细胞。利用血细胞计数板计数后,按照需要的密度将神经元接种于预铺过0.1mg/mL多聚赖氨酸的培养皿或者培养板中,于5%C02及37℃恒温的条件下进行培养。DRG神经元培养液成分为：Neurobasal培养基+2%B27+双抗(青霉素和链霉素)+0.5mM谷氨酰胺。DRG神经元转染采用电转染和病毒感染两种方法。电转染采用Amaxa Biosystems公司的细胞电转染仪Nucleofector进行,具体方法见该产品的使用说明书。病毒感染采用慢病毒直接感染细胞。 2.免疫荧光细胞化学染色定量分析膜表面受体水平 PC12细胞或DRG神经元转染Flag-Trk-GFP质粒,这种外源表达的Trk受体胞外N末端带有Flag标签蛋白,胞内C末端融合一个绿色荧光蛋白。细胞利用4%多聚甲醛固定5分钟后,50%二抗来源的血清室温封闭1小时,然后利用Flag标签蛋白的抗体进行孵育。最后红色荧光素标记的二抗孵育完成后封片观察。在未透化的条件下,红色荧光二抗标记的为定位于细胞膜表面的Flag-Trk-GFP受体,而绿色荧光蛋白代表细胞内总的Flag-Trk-GFP受体。我们利用红色荧光和绿色荧光强度的比值来相对定量细胞膜表面的Flag-Trk-GFP受体水平。 3.蔗糖密度梯度离心分析TrkA受体在内质网和高尔基体的定位 PC12细胞利用电转染方法外源表达Flag-TrkA受体。48小时后,0.25%胰酶／1mM EDTA消化后,将细胞吹落并收集于离心管中离心。PBS及sucrose buffer (250mM葡萄糖,10mM triethylamine, pH7.4,1mM EDTA)各洗一次。离心后去上清,加入0.5mL匀浆液(320mM葡萄糖,10mM Hepes PH7.2,各种蛋白酶抑制剂)重悬后,移入匀浆器内冰上匀浆(30下左右)。离心后将上清液加于蔗糖密度梯度(由下而上依次为55%、40%、30%、15%)之上,4℃,105000g,离心2h。离心完成后,样品由上到下冰上分层取样,平均分为13份。蛋白样品高温变性后进行蛋白Western检测,分别利用内质网标志蛋白Calnexin、高尔基体标志蛋白GM130标定内质网和高尔基组分的分布,利用Flag标签抗体检测Flag-TrkA在各样品中含量。 4.分离培养DRG神经元的凋亡实验 DRG神经元培养接种后分别加入NGF (50ng/ml)和BDNF (50ng/ml)进行培养,持续5-7天后分别获得NGF依赖的和BDNF依赖的DRG神经元。将含高浓度神经营养因子的培养基换为含1.25ng/mINGF或BDNF的培养基培养神经元24小时诱导DRG神经元凋亡。然后,采用Roche公司的脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL)试剂盒评估神经元的凋亡,具体方法见该产品的使用说明书。 研究结果 1.STX8与TrkA受体结合但与TrkA的同源性受体TrkB不结合 我们分别利用过表达STX8和TrkA或者TrkB受体的HEK293细胞进行外源免疫共沉淀实验,利用大鼠背根神经节进行内源的免疫共沉淀实验证实STX8能够与神经生长因子NGF的高亲和性受体TrkA结合而与它的同源性分子BDNF(脑源性神经营养因子)的高亲和性受体TrkB不结合。并且通过免疫化学染色发现STX8与TrkA在大鼠背根神经节DRG神经元中存在共表达,在培养的DRG神经元中也存在很好的共定位,这些证据都证实STX8与TrkA是可以发生相互作用的。 2.STX8调节TrkA受体膜表面水平但对TrkB没有调节作用 既然STX8与TrkA存在相互作用,而STX8又是参与调节蛋白转运的SNARE家族成员之一,所以接下来我们检测STX8是否因调节TrkA的转运而影响TrkA的膜表面水平。我们首先利用受体膜表面分布水平免疫荧光定量分析方法及生物素膜表面蛋白标记法来检测TrkA膜表面的水平变化,发现过表达STX8可以引起TrkA膜表面水平相应增加,而利用缺失跨膜域的STX8dominant negative及STX8siRNA来分别抑制内源STX8的功能或表达可以引起TrkA膜表面水平的下降,而STX8表达的变化对TrkB的膜表面水平没有影响。接下来在背根神经节神经元中我们利用荧光定量分析法和生物素法分别对以上结果进行了验证。这些结果提示STX8对于TrkA的膜表面水平具有调节作用。 3. TrkA的C末端域对于TrkA/STX8的相互作用是充分和必要的 为了进一步了解STX8调节TrkA膜水平的机制,我们利用分子克隆构建了TrkA不同区域的缺失突变体及与TrkB相应区域的替换突变体,通过免疫共沉淀来研究TrkA与STX8的具体结合区域。我们发现缺失C末端的TrkA△CT不能和STX8结合而替换了TrkA的C末端的TrkB嵌合体TrkBAct能够与STX8结合,这说明TrkA的C末端域介导了TrkA和STX8的结合,并且此区域是两个蛋白结合的充分和必要条件。免疫荧光定量分析发现了STX8过表达可以增加TrkBAct膜表面的分布,说明STX8通过与TrkA的CT区结合介导了对TrkA的膜表面分布的调节。 4.STX8调节TrkA合成后向质膜的转运 由于TrkA的膜表面水平同时受合成后上膜及内吞下膜的双重调节,因此接下来我们就研究了STX8是调节TrkA上膜过程还是内吞的下膜过程。我们首先利用免疫荧光定量分析受体内吞的方法发现过表达或干扰STX8的表达不影响TrkA受体的内吞比率。之后我们又通过可裂解生物素检测内吞的方法对以上结果进行了验证,证实STX8确实不参与调节TrkA受体的内吞过程。最后我们利用dominant negative dynaminK44A抑制内吞发现STX8对于TrkA膜表面水平的调节仍然存在,这说明STX8参与调节TrkA合成后向膜的转运,进而影响了膜表面的水平。 5.STX8调节TrkA从Golgi的反面膜囊向外运出的过程 蛋白合成后到膜表面须经历从内质网到高尔基,再从高尔基到质膜的转运,为研究STX8调节TrkA合成后转运发生的具体环节,我们首先通过TrkA分别与内质网标志性蛋白Calnexin及高尔基标志性蛋白TGN38的共定位分析来确定STX8是否调节TrkA在细胞器的定位。我们发现过表达STX8可以减少TrkA在高尔基的定位,而抑制STX8会增加TrkA在高尔基的定位,而STX8表达的变化不影响TrkA在内质网的定位,这个结果提示STX8参与调节TrkA从高尔基的运出过程。接下来我们利用蔗糖密度梯度离心的方法将细胞各细胞器的组分进行相对分离,通过Western blot检测TrkA在各组分的含量,同样发现过表达STX8降低了TrkA在高尔基的比例,抑制STX8增加TrkA在高尔基的含量,而对TrkA在内质网的含量没有影响,此结果再次证实STX8调节TrkA从高尔基向质膜的转运。 6.STX8调节TrkA介导的信号通路的传导及NGF依赖的背根神经节的存活 NGF与定位于细胞膜上的TrkA结合,引起TrkA的磷酸化,进而引起下游信号分子的激活。我们通过Western blot分别检测STX8对TrkA及其下游分子Akt、Erk1/2激活的影响,发现过表达STX8可以增加NGF刺激引起的p-TrkA、p-Akt及p-Erk的水平,而抑制STX8可以减少NGF刺激引起的这些分子的激活,这些结果同STX8对TrkA膜表面水平的调节也是相一致的。DRG神经元的存活依赖于不同的神经营养因子,我们利用NGF及BDNF分别对DRG神经元进行筛选得到NGF依赖的和BDNF依赖的DRG神经元。筛选过程中分别对这两种神经元进行慢病毒转染使其携带STX8或STX8dominant negative的基因,之后利用Tunel染色及caspase3检测凋亡。我们发现STX8可以调节NGF依赖的DRG神经元的存活,但对BDNF依赖的神经元的存活没有影响。 7.体内敲除大鼠背根神经节神经元STX8的表达对炎性痛起镇痛作用 NGF/TrkA信号通路在炎性痛的传导中起着重要作用,为确定STX8是否通过调节TrkA影响炎性痛的传导,我们利用髓鞘注射腺相关病毒AAV6-siSTX8敲除大鼠背根神经节STX8的表达来检测STX8对福尔马林诱导的炎性痛的影响。发现敲除STX8能够明显的减少福尔马林诱导的大鼠在第二时相的舔爪子时间,证实抑制STX8对炎性痛可以起到镇痛作用。 结论 1.STX8调节TrkA受体从高尔基向细胞膜的转运,进而对细胞膜表面的TrkA的水平进行调节。 2.STX8通过与TrkA的C末端区域结合来调节TrkA的转运,但对TrkB没有调节作用。这种不同是由TrkA和TrkB的C末端区域的不同所导致的。 3.STX8调节NGF介导的生物学功能,包括NGF依赖的背根神经节神经元的存活及疼痛的传导。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R363
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