人参皂甙Rd抑制脊髓缺血再灌注损伤后神经元的凋亡

发布时间：2018-08-19 13:13

【摘要】：在脊髓缺血再灌注损伤造成的迟发性瘫痪中，神经元凋亡是细胞死亡的主要方式，是造成治疗困难、疗效不明显的重要原因之一。ASK1-JNK/P38MAPK途径是调节细胞凋亡的重要信号传导途径，抑制ASK1信号通路可减少细胞凋亡的发生。人参皂甙Rd是人参的主要成份之一，既往实验表明Rd对缺血性脑卒中具有明确的神经保护作用，对于同属中枢神经系统的脊髓组织，Rd是否同样发挥保护作用，至今未见报道。本实验通过建立大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型，观察腹腔注射Rd后大鼠后肢运动功能改善程度、组织病理变化及神经细胞凋亡情况，探讨Rd对脊髓缺血再灌注损伤是否具有神经保护作用，以及这种作用是否与抑制神经细胞凋亡有关，为进一步明确Rd的药理作用及应用于临床治疗提供实验依据。目的：观察人参皂甙Rd对SD大鼠脊髓缺血再灌注损伤后运动功能的改善情况并通过行为学分析、特殊染色、免疫组织化学染色、Western blot等方法相结合，揭示其可能的分子机制。方法： 1、确定最佳治疗剂量随机选择SD大鼠30只，分为假手术组（Sham组）、缺血/再灌注损伤组（I/R组）、6.25mg/kg Rd组、12.5mg/kg Rd组、25mg/kg Rd组、50mg/kg Rd组，每组5只；其中6.25mg/kg Rd组、12.5mg/kg Rd组、25mg/kg Rd组、50mg/kg Rd组为治疗组。假手术组，仅打开腹腔，不夹闭腹主动脉；I/R组，麻醉后切开大鼠腹腔，用动脉夹阻断肾动脉水平以下腹主动脉60分钟后关腹，建立脊髓缺血/再灌注损伤模型；治疗组，按照I/R组方法造成脊髓缺血/再灌注损伤模型，6.25mg/kg Rd组，每只鼠按照6.25mg/kg·d剂量给予人参皂甙Rd腹腔注射；12.5mg/kg Rd组，每只鼠按照12.5mg/kg·d剂量给予人参皂甙Rd腹腔注射；25mg/kg Rd组，每只鼠按照25mg/kg·d剂量给予人参皂甙Rd腹腔注射；50mg/kg Rd组，每只鼠按照50mg/kg·d剂量给予人参皂甙Rd腹腔注射。模型建立后每日观察SD大鼠后肢及尾部运动情况，进行BBB评分。全部30只SD大鼠于术后第5日处死，小心剥离胸13水平以下的脊髓组织，置于10%中性福尔马林液4℃固定24小时，以腰2为中心修块，长度3.0mm，常规石蜡包埋、固定，石蜡切片，苏木精-伊红染色（HE染色），根据实验结果确定最佳治疗剂量。 2、确定最佳治疗时间随机选择SD大鼠20只，分为建模后1天组、建模后3天组、建模后5天组、建模后7天组，每组5只；四组均建立脊髓缺血再灌注损伤模型，具体方法同前，术后每日观察SD大鼠下肢及尾部运动情况，进行BBB评分，根据上一步实验结果，各组每日均给予相同剂量（即前一步确定的最佳剂量25mg/kg·d）Rd腹腔注射；分别于建模后不同时间处死各组SD大鼠，取出脊髓组织进行HE染色，方法同上，根据BBB评分及染色结果来确定最佳治疗时间。具体情况为建模后1天组于建模后第1日处死，建模后3天组于建模后第3日处死，建模后5天组于建模后第5日处死；建模后7天组于建模后第7日处死。 3、大鼠脊髓切片的尼氏染色和Caspase3染色尼氏染色法：石蜡切片常规脱蜡，0.25%的甲苯胺蓝50℃3小时，脱色，脱水，，透明，中性树胶封片。采用OLYMPUSBX53显微镜(Olympus)观察，并用CellSens Dimension摄像系统(Olympus)显微摄影。所得图片采用Image-Pro Plus6.0软件进行图像分析，并测得其灰度值。Caspase3染色方法：石蜡切片脱蜡和水化后，过氧化酶阻断溶液孵育，正常非免疫动物血清孵育后，每张切片加50μl羊抗鼠Caspase3抗体（稀释度1：250）孵育60min，生物素标记的抗羊免疫球蛋白试剂（试剂盒自带）孵育，链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液孵育，新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察，苏木素复染，返蓝；梯度酒精脱水、透明，中性树胶封固。免疫组织化学染色的标本中，Caspase3阳性神经细胞的细胞质内含棕色颗粒，非阳性神经细胞的细胞质内无棕色颗粒。统计脊髓灰质内阳性神经细胞数和神经细胞总数。计算Caspase3表达的阳性率，Caspase3表达的阳性率=阳性神经细胞数/神经细胞总数×100%。Caspase3的表达情况是由阳性细胞的百分率和阳性细胞表达强度共同决定的，阳性细胞百分率的得分是0（0%），1（1-10%），2（11-50%），3（51-80%），4（80%）；表达强度的得分是1（弱度），2（中度），3（强度）。最后的得分是表达率与表达强度得分的总和，总得分可以分为以下几组：不表达（得分2），低表达（得分=2-3），中表达（得分=4-5），高表达（得分=6-7）。 4、Western blot方法检测p38MAPK、ASK1、JNK 随机选择SD大鼠24只，分为对照组（Control组）、假手术组（Sham组）、缺血/再灌注损伤组（I/R组）、治疗组（Treat组），每组6只。Control组，仅给予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，不打开腹腔，术后每日腹腔注射生理盐水；Sham组，仅打开腹腔后关腹，术后每日腹腔注射生理盐水；I/R组，采用前述方法造成脊髓缺血再灌注损伤，术后不给予人参皂甙Rd，每日只给予腹腔注射生理盐水；Treat组，建模方法同I/R组，参考前述实验确定的最佳治疗剂量和最佳治疗时间结果，每日给予人参皂甙Rd腹腔注射进行治疗。全部24只SD大鼠均于同一时间处死。游离出脊髓组织，置于匀浆器中裂解，匀浆并离心后测蛋白浓度。应用蛋白测定试剂盒绘制标准蛋白曲线，根据测得的样品浓度，将样品稀释为统一浓度后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿法转膜。加入WB二抗进行免疫反应，化学发光、显色、定影，图像分析。采用Tanon Gel Image SystemID4.1.2系统进行图像摄影并分析。结果： 1、通过结合各组大鼠BBB评分和HE染色切片评分，确定Rd的最佳治疗剂量为25mg/kg·d。各组大鼠BBB评分的比较采用重复测量方差分析，组间比较（F=220.03,P0.001），不同时间比较（F=213.52, P0.001），剂量与时间存在交互作用（F=19.83,P0.001）。组间两两比较采用SNK检验，Sham组与其他5组比较均有差别（P0.05），且Sham组评分均数最高（X=20.9）；I/R组与其他4组比较均有差别（P0.05），且I/R组评分均数最低（X=11.1）；除6.25mg/kg Rd组与12.5mg/kg Rd组之间、25mg/kgRd组与50mg/kg Rd组之间比较无差别（P0.05），治疗组（6.25，12.5，25，50mg/kgRd组）各组之间均有差别（P0.05），且各组随Rd腹腔注射剂量增加，BBB评分有逐渐增高的趋势，6.25，12.5，25，50mg/kg Rd组每组BBB评分均数分别为（X=13.0,13.1,15.3,15.4），说明人参皂甙Rd的剂量与BBB评分的改善之间存在效应-剂量关系。在术后不同时间比较中，治疗组随Rd腹腔注射剂量增加，除6.25mg/kg Rd组术后第1、2天之间比较无差别（P0.05），其余Rd组术后第1、2、3、4天之间比较均有差别（P0.05），治疗组每个剂量组在第4、5天之间比较无差别（P0.05），提示到第4天后，BBB评分进入一个平台期。各组HE染色切片评分结果比较采用单因素方差分析（F=32.25, P0.001），组间两两比较采用SNK检验。除25mg/kg Rd组与50mg/kg Rd组比较无差别（P0.05）外，其余任意两组之间均有差别（P0.05）。故选择最佳治疗剂量为25mg/kg·d。 2、通过结合各组大鼠BBB评分和HE染色切片评分，确定Rd的最佳治疗时间为5天。建模后7天组不同时间的BBB评分比较采用单因素方差分析（F=4.55, P=0.002），组间两两比较采用SNK检验，除术后第1天与第4、5、6、7天之间比较有差别（P0.05）外，其余任意两组之间比较均无差别（P0.05）。说明治疗有效；HE染色切片显示微观结构改变与行为学表现的改善相一致，脊髓组织的缺血再灌注损伤明显减轻。对各组HE染色切片评分比较，采用单因素方差分析（F=3.66, P=0.035），组间两两比较采用SNK检验，建模后5天组与建模后1天组、建模后3天组比较均有差别（P0.05），与建模后7天组比较无差别（P0.05）；建模后1天组与建模后3天组、建模后7天组比较无差别（P0.05）；建模后3天组与建模后7天组比较无差别（P0.05）。故选择最佳治疗时间为5天。 3、尼氏染色与Caspase3染色结果提示Rd对脊髓缺血再灌注损伤的神经保护作用主要与治疗剂量相关。尼氏染色结果显示在Sham组，脊髓前角运动神经元体积较大，细胞核染色浅，核仁清晰，细胞质中尼氏体含量较多。I/R组；脊髓前角运动神经元体积较大，细胞核染色浅，核仁清晰，细胞质内尼氏体边集，且染色深，6.25mg/kg Rd组：脊髓前角运动神经元细胞核染色浅，核仁清晰，细胞质内尼氏体含量较多，但较缺血组有所减少，且染色不如缺血组的尼氏体染色深。12.5mg/kg Rd组、25mg/kg Rd组、50mg/kgRd组：脊髓前角运动神经元细胞核染色浅，核仁清晰，细胞质内尼氏体含量多。测得的灰度值两组间比较采用配对t检验，Sham组与I/R组、6.25mg/kg Rd组、12.5mg/kg Rd组、25mg/kg Rd组、50mg/kg Rd组相比较，差别有显著性（P0.05）；6.25mg/kg Rd组与I/R组相比较，差别有显著性（P0.05）；12.5mg/kg Rd组与6.25mg/kg Rd组、25mg/kg Rd组与12.5mg/kg Rd组、50mg/kg Rd组与25mg/kg Rd组相比较，差别无显著性（p0.05）。建模后1天组，建模后3天组，建模后5天组，建模后7天组，尼氏染色结果显示各组脊髓前角运动神经元细胞核染色浅，核仁清晰，细胞质内尼氏体含量多，随治疗时间延长，测量其灰度值变化，差别无显著性（p0.05）。Caspase3染色结果评分后，两组间比较采用配对t检验，I/R组评分与Sham组差异有显著性（p0.01），I/R组可见Caspase3阳性颗粒，说明部分神经元细胞在脊髓缺血再灌注损伤后发生了凋亡；给予腹腔注射Rd治疗后，6.25mg/kg Rd组评分与I/R组评分比较，差异有显著性（p0.01），I/R组高于6.25mg/kg Rd组，说明治疗有效；随着Rd浓度的增加，12.5mg/kgRd组评分与6.25mg/kg Rd组评分比较，差异仍有显著性（p0.05），6.25mg/kg Rd组高于12.5mg/kg Rd组，说明Rd对Caspase3表达的抑制作用呈浓度依赖式；随着Rd浓度再进一步增加，25mg/kg Rd组、50mg/kg Rd组的评分与Sham组比较，差异已无显著性（p0.05），说明经Rd积极治疗后，Caspase3的表达已经很少，甚至无表达。而在建模后1天组、建模后3天组、建模后5天组、建模后7天组，Caspase3染色结果提示，神经元细胞大，细胞核圆，神经细胞的细胞质内无Caspase3阳性颗粒生成，各组比较差异无显著性（p0.05）。这一结果说明，在给予特定浓度Rd治疗的情况下，随着治疗时间延长，Caspase3阳性细胞变化不明显，提示Caspase3的表达对Rd的浓度变化较为敏感，对治疗时间不敏感。 4、Western blot结果显示Rd主要是通过ASK1-JNK途径抑制脊髓缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡的发生，而非p38MAPK。对于ASK1和JNK，I/R组与Sham组相比较，差异有显著性（p0.01），说明模型建立成功；Treat组与I/R组相比较，差异有显著性（p0.05），说明腹腔注射Rd治疗有效，ASK1、JNK表达均下降。对于p38MAPK，I/R组与Sham组相比较，差异具有显著性（p0.01），说明模型建立成功；Treat组与I/R组相比较，差异无显著性（p0.05），说明Rd主要是通过ASK1-JNK途径发挥神经保护作用，而非p38MAPK。结论：人参皂甙Rd对于大鼠脊髓缺血再灌注损伤后运动功能障碍可发挥明确的神经保护作用，腹腔注射Rd不仅可以明显改善大鼠的后肢运动功能（BBB评分），改善微观组织结构病理性损害（HE染色），还可以减少神经元凋亡；尼氏染色与Caspase3染色结果提示，Rd主要以剂量依赖方式来发挥作用，抑制Caspase3的表达，对治疗时间的变化不敏感；Rd通过抑制神经细胞凋亡来发挥神经保护作用，与Rd对ASK1信号通路的表达抑制相关，主要是通过ASK1-JNK途径，减少Caspase3的表达，而不是ASK1-p38MAPK途径。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R651.2

【参考文献】