髓系来源的抑制性细胞在胶原诱导性关节炎发病机制及青藤碱对其干预作用的研究

发布时间：2018-10-09 09:45

【摘要】：研究背景髓系来源的抑制性细胞(myeloid derived suppressor cells, MDSCs)是一群异质性细胞,包括髓系祖细胞和未成熟的髓系细胞(immature myeloid cells, IMCs)。在健康人,IMCs在骨髓中产生,迅速分化为成熟的粒细胞、巨噬细胞或树突状细胞。相对而言,在病理状态,比如肿瘤、各种感染性疾病、败血症、骨髓移植和某些自身免疫性疾病,IMCs分化为成熟髓系细胞受阻导致这群细胞大量扩增。重要的是在病理状态下IMCs的活化导致免疫抑制因子的表达上调,比如精氨酸酶 1 (arginase 1,ARG1)、诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)及其产物一氧化氮(nitric oxide,NO)的增加和活性氧簇(reactive oxygen specicies,ROS)。在小鼠,MDSCs表达髓系细胞的标记Gr-1(Ly6G和Ly6C)和CD11b。正常小鼠骨髓中包含50%～60%具有这群细胞表型的细胞,但在脾中只占到2%～5%。在人,MDSCs通常被定义为CD14-CD11b+,更严格地讲,这群细胞表达了共同的髓系标志CD33,而缺乏成熟的髓系和淋巴系细胞的标志以及主要组织复合物II类分子人类白细胞抗原 DR (human leukocyte antigen DR, HLA-DR)。近来,根据Gr-1表达的不同,MDSCs形态上的异质性在小鼠被更精确的定义:粒细胞MDSCs 具有 CD11b.4-Ly6G+Ly6Clow表型(G-MDSCs),而单核细胞 MDSCs 具有CD 1 1b+Ly6G-Ly6Chi 表型(M-MDSCs)。尽管MDSCs最初在肿瘤动物模型和肿瘤患者中报道,随着自身免疫性疾病的动物模型的建立,MDSCs在自身免疫性疾病中的研究逐渐成为研究的焦点。在实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)、自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)、炎症性肠道疾病(inflammatory bowel disease,IBD)、实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎(experimental autoimmune uveoretinitis,EAU)及系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)的小鼠模型中都有相关报道。而在类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)及其动物模型中却鲜有研究。RA是一种以关节滑膜组织慢性炎症为主要表现的系统性自身免疫性疾病。在RA的发病过程中,持续性和进展性的外周关节滑膜炎症、血管翳形成,并出现骨和软骨的破坏,最终导致关节畸形和功能障碍。因此,阻止骨破坏成为治疗RA的主要目标之一。近年来,RA的治疗取得显著的进展。“达标治疗”(treat-to-target)策略的提出,对RA的治疗具有重要的指导意义。生物或非生物改善病情抗风湿药(modifying anti-rheumatic drugs, DMARDs)在改善症状、长期疗效和 RA 患者生活质量方面都有巨大进步。但是,仍有许多患者遭受严重的骨破坏。胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis, CIA)模型是通过用Ⅱ型胶原(collagentypeⅡ,CⅡ)免疫大鼠(小鼠)诱导的多关节炎症。主要特征表现为外周多发性关节炎,后肢较前肢更易受累,无血管炎变现,也无反复出现的关节症状。其发生机制是被CⅡ活化的巨噬细胞和T细胞浸入滑膜内层,释放炎症因子,接着粒细胞等入浸,共同形成血管翳,破骨细胞(osteoclast, OC)和胶原酶的作用导致骨结构的丧失。该模型在发病机制、临床表现、病理组织学和免疫学等方面具有与人类RA有很多相似的特征,被认为是目前研究RA的公认动物模型,较广泛地用于RA发病机制以及治疗RA的药物研究。其中,两者显著的共同点之一是在滑膜组织中活化的OCs导致的关节破坏。OCs是具有骨吸收能力的多核巨细胞。在正常情况下,OCs的生成和骨成型主要发生在骨髓腔内。破骨细胞前体(osteoclast precursors,OCPs)起源于骨髓造血干细胞。受到多种因素影响的造血干细胞分为:共同的淋巴样祖细胞和共同的髓样祖细胞。共同的淋巴样祖细胞生成T、B淋巴细胞以及自然杀伤(natural killer,NK)细胞。B220+前B细胞有形成OCs的能力,成熟的T、B淋巴细胞不能形成OCs,但是可以通过产生核因子-κB受体激活配体(receptor activator of NF-κB ligand, RANKL)或骨保护素(osteoprotegerin,OPG)间接影响OCs生成。来源于RA患者滑液的NK细胞诱导CD14+单核细胞分化为OCs。共同的髓样祖细胞生成巨核细胞、红细胞和粒/巨噬细胞祖细胞。成克隆实验表明巨核细胞和红细胞祖细胞不能产生粒细胞和巨噬细胞集落形成单位(colony-forming units for granulocytes and macrophage,CFU-GMs),意味着它们没有形成OCs的潜能。像T、B淋巴细胞一样,巨核细胞通过产生转化生长因子-β (transforming growth factor-β,TGF-β)和血小板源性生长因子(platelet-derived growthfactor,PDGF)间接调控OCs形成。粒/巨噬细胞祖细胞进一步分化为成熟的粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞和OCs。在巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)和RANKL的作用下,巨噬细胞和树突状细胞又分化为OCs。前期的研究结果表明在CIA小鼠外周血、脾细胞及骨髓MDSCs细胞比例增加,在小鼠关节滑膜组织中也发现这群细胞的聚集,且这群细胞比例的增加与小鼠关节炎评分呈正相关。那么,在大量扩增的这群细胞是如何影响CIA的病情呢?同时考虑到,MDSCs可以分化巨噬细胞和树突状细胞,而巨噬细胞和树突状细胞做为OCPs,可以在M-CSF和RANKL的作用下诱导分化为OCs,据此,我们推测MDSCs可能诱导分化为OCs。MDSCs在免疫微环境中扮演着重要的角色,针对MDSCs分化中的各个环节以及对其功能的研究也日趋清晰,靶向MDSCs的治疗方法也在不断进展,大致可分为4个方面:促进MDSCs分化、抑制MDSCs成熟、阻止MDSCs在外周器官的聚集及调控MDSCs发挥抑制功能的分子。IL-1β、IL-6等细胞因子以及 MMP-9 调控着 MDSCs 成熟。另外,环氧化酶-2 (cyclooxygenase 2,COX-2)是一个重要的调控MDSCs抑制功能的靶点。RA属于祖国传统医学“痹病”或“痹证”范畴。最早记载于《内经》,称之为“痹”。《素问·痹论》言“所谓痹者,各以其时重感于风寒湿之气也”,又言“风寒湿三气杂至合而为痹也。风气盛者为行痹,寒气盛者为痛痹,湿气盛者为着痹”......痹证以祛风通络为治疗大法,治以祛风、除湿、散寒、舒经活络,病程日久者配合补益之法。青藤碱(sinomenine,SIN)是从中药清风藤中提取的单体生物碱,具有显著的抗炎、镇痛、免疫抑制等多种药理作用。清风藤开始应用于风湿性疾病的治疗已有1000多年的历史。SIN可通过影响成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)代谢周期、增殖和凋亡等几方面调控着滑膜炎症;抑制树突状细胞活性、表面分子和趋化因子的表达;抑制炎症因子IL-1β、IL-6和COX-2释放。因此,我们推测,SIN可能通过抑制IL-1β、IL-6、COX-2等的表达,而抑制MDSCs的成熟以及功能发挥。研究目的1.在CIA小鼠模型中,探索MDSCs与CⅠA发病可能的机制;2.体外诱导MDSCs分化为OCs,探讨MDSCs与CⅠA骨破坏的关系;3.研究青藤碱对MDSCs的影响,进一步证实MDSCs在CⅠA骨破坏中重要作用。方法1.MDSCs在CIA小鼠中的比例、表型及抑制功能研究C57BL/6(H-2b)小鼠60只,雄性,8～10周龄。CⅡ溶解于10mM的乙酸,浓度为2mg/ml,搅拌,4℃过夜充分溶解。将溶解的CⅡ与CFA等体积混合,冰浴中使用匀浆器充分乳化。使用带有26G针头1ml注射器吸取CⅡ/CFA乳剂,于小鼠尾根部多点皮内注射100ul乳剂。初次免疫后第14天后,将CⅡ/IFA等体积混合乳化,100ul每只,避开初次免疫部位进行加强免疫。初次免疫后每周3次记录小鼠关节炎评分。观察结束后,乙醚麻醉后脱臼处死小鼠,收集小鼠双侧后肢,常规脱钙,随后进行关节滑膜组织的固定、脱水、透明、透蜡、包埋、切片以及HE染色。免疫4周后,流式细胞术检测小鼠外周血(peripheral blood,PB)、脾细胞(splenocytes,SP)、骨髓(bone marrow, BM)MDSCs及亚群水平;免疫荧光检测小鼠关节滑膜Gr-1+细胞的浸润;免疫磁珠及流式细胞术分选MDSCs及其亚群G-MDSCs和M-MDSCs; 3H-TdR检测MDSCs、G-MDSCs和M-MDSCs对T细胞增殖的影响;ELISA检测细胞培养上清IFN--γ水平。2.MDSCs分化为OCs的研究C57BL/6小鼠用C@/CFA免疫4周,免疫磁珠分选未免疫和CIA小鼠脾MDSCs,400μl体系接种2×105细胞到培养小室,20ng/ml的M-CSF刺激3天,随后20ng/ml M-CSF和100ng/ml RANKL培养6天,结束后,进行细胞固定以及TRAP染色。C57BL/6小鼠用CⅡ/CFA免疫4周,流式细胞术分选CIA小鼠脾MDSCs亚群G-MDSCs和M-MDSCs。用上述方法进行诱导培养,结束后,进行细胞固定以及TRAP染色。2×104MDSCs、M-MDSCs和G-MDSCs接种于96孔 Osteo Assay surface plate,培养体系为400μl α-MEM(含 10%FBS); 20ng/ml M-CSF刺激3天,随后用20ng/ml M-CSF和100ng/mlRANKL培养6天,吸走培养液,加入100ul/孔10%漂白剂移除细胞,室温空气干燥;在显微镜下观察,随机选取6个视野拍摄照片,采用NIS-Elements软件进行图像分析,计算并比较各组陷窝面积。3.青藤碱对CIA小鼠MDSCs的干预研究C57BL/6(H-2b)小鼠,雄性,8～10周龄。CⅡ/CFA乳剂诱导CIA模型,初次免疫后第14天后,将CⅡ/IFA等体积混合乳化,行加强免疫一次。分为实验组和对照组,实验组于初次免疫后的第35d每日给予SIN100mg/kg灌胃,对照组给予PBS,至观察结束。初次免疫后每周3次记录小鼠关节炎评分。观察结束后,乙醚麻醉后脱臼处死小鼠,收集小鼠双侧后肢,常规脱钙,随后进行关节滑膜组织的固定、脱水、透明、透蜡、包埋、切片以及HE染色。对炎症细胞的浸润、软骨的破坏和骨侵蚀三方面进行关节滑膜病理评分。流式细胞术检测小鼠 PB 和 SP MDSCs 及 SP G-MDSCs 和 M-MDSCs 水平。口服 SIN 或 PBS后收集 CIA 小鼠脾,RT-PCR 检测 IL-1β,IL-6, COX-2, TRAP,CTR 和 MMP-9 mRNA表达。4.统计学处理采用SPSS13.0统计软件进行分析,计量资料用(均数±标准差)(x±s)表示。正态分布计量资料两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析或重复测量的方差分析,组间多重比较采用Bonferroni或Dunnett's T3法,显著性水平α =0.05,以双侧P0.05为差异有统计学意义。结果1. MDSCs在CIA小鼠中的比例、表型及抑制功能研究1.1 CIA模型的鉴定及评价小鼠初次免疫后18天出现关节红或肿胀,首发多为趾间关节,随后蔓延至足皮垫、踝关节。初次免疫后28天红肿及多关节炎病变达高峰,观察到第50天时发生率为60%,对照组小鼠无关节炎改变。病理学观察结果显示:正常小鼠滑膜组织排列规则,未见淋巴细胞、浆细胞的浸润,软骨及骨的破坏;模型组小鼠关节滑膜组织重度增生,滑膜层变厚,大量淋巴细胞、中性粒细胞的浸润,软骨及骨的破坏。1.2 MDSCs及亚群G-MDSCs和M-MDSCs在CIA小鼠聚集诱导4周后,流式细胞术检测小鼠PB、SP和BM MDSCs水平,结果显示与对照组相比,CIA小鼠PB、SP和BM MDSCs水平显著升高,差异均具有统计学意义(t=-18.77、-9.48 和-8.48, P均0.001)。诱导4周后,流式细胞术检测小鼠SPMDSCs亚群水平,结果显示与对照组相比,CIA小鼠SPG-MDSCs和M-MDSCs水平均显著升高,差异具均有统计学意义(t=-5.18和-4.90,P均0.05)。分别在 0d、7d、14d、21d、28d、35d 和 42d 动态分析 CIA 小鼠 PB CD11b+Gr-1+MDSCs变化,结果发现CD11b+Gr-1+MDSCs的比例随发病天数增加呈上升趋势,CD11b+Gr-1+MDSCs的比例在第28天达到峰值(43.34±4.30) %,第35天左右开始减低(36.59±8.31) %。随后用免疫荧光检测了关节Gr-1+细胞的募集,发现大量Gr-1+细胞浸润到CIA小鼠关节滑膜,然而,对照组小鼠关节未见Gr-1+细胞。1.3CIA进展过程中MDSCs的表型特征免疫4周后,流式细胞术分析SP MDSCs表型特征,结果显示对照组及CIA小鼠 CD11b+Gr-1+MDSCs 均不表达 CD11c、MHC-Ⅱ、F4/80 和 CD80,而表达CD115、CCR2 和 CD62L。更有意思的是对照组及CIA小鼠PB、SP和BM CD11b+Gr-1+ MDSCs表达了OCs 的特异性标记 CD51,并且 CIA 小鼠 PB、SP 和 BM CD11b+Gr-1+ MDSCs表达更高水平的 CD51 (60.61% vs 72.24%, 29.30% vs 38.80%, 52.66% vs 58.84%)。1.4 CIA小鼠MDSCs抑制由CD3/CD28共刺激的T细胞的活化1.4.1 MDSCs及亚群影响T细胞增殖未免疫的脾细胞用CD3和CD28mAb刺激后与不同比例的脾CD11b+Gr-1+MDSCs共培72小时,3H-TdR掺入检测细胞增殖。结果表明:经Levene检验方差不齐,F=3.84,P=0.039。近似F检验Welch法显示F=323.41,v=3,P=0.000,多重比较结果显示:(MDSCs:Splenocytes)为(1:2)组与不加MDSCs组相比,显著抑制T细胞增殖(P=0.001)。同样,(MDSCs:Splenocytes)为(1:1)组与不加MDSCs组相比,也显著抑制T细胞增殖(P=0.000)。未免疫的脾细胞用CD3和CD28 mAb刺激后与不同比例的G-MDSCs共培72小时,3H-TdR掺入检测细胞增殖。结果表明:经Levene检验方差不齐,F=5.127,P=0.016。近似F检验Welch法显示F=1382.751,v=3, P=0.000,多重比较结果显示:(G-MDSCs:Splenocytes)即(1:2)和(1:1)组与不加G-MDSCs组相比,差异均无统计学意义(P=0.074和P=0.092)。未免疫的脾细胞用CD3和CD28 mAb刺激后与不同比例的脾M-MDSCs共培72小时,3H-TdR掺入检测细胞增殖。结果表明:经Levene检验方差不齐,F=7.042, P=0.005。近似 F 检验 Welch 法显示F=1382.751,v=3,P=0.000,多重比较结果显示:(M-MDSCs:Splenocytes)为(1:2)组与不加MDSCs组相比,显著抑制T细胞增殖(P=0.000)。而(MDSCs:Splenocytes)为(1:1)组与不加M-MDSCs组相比,也同样显著抑制T细胞增殖(P=0.000)。1.4.2细胞培养上清IFN-y水平未免疫的脾细胞用CD3和CD28 mAb刺激后与不同比例的脾MDSCs共培56小时后收集细胞培养上清,ELISA检测IFN-γ水平。结果显示:经Levene检验方差不齐,F=3.491,P=0.05。近似F检验Welch法显示F=1832.78, v=3, P=0.000,多重比较结果显示:(MDSCs:Splenocytes)为(1:2)组与不加MDSCs组相比,IFN-γ水平显著降低(P=0.000)。同样,(MDSCs:Splenocytes)为(1:1)组与不加MDSCs组相比,IFN-γ水平显著降低(P=0.000)。未免疫的脾细胞用CD3和CD28 mAb刺激后与不同比例的脾G-MDSCs共培56小时后收集细胞培养上清,ELISA检测IFN-γ水平。结果显示:经Levene检验方差不齐,F=12.586, P=0.001。近似 F 检验 Welch 法显示 F=26188.37, v=3, P=0.000,多重比较结果显示:(G-MDSCs:Splenocytes)即(1:2)和(1:1)组与不加G-MDSCs组相比,IFN-γ水平差异均无统计学意义(P=0.115和P=0.795)。未免疫的脾细胞用CD3和CD28 mAb刺激后与不同比例的脾M-MDSCs共培56小时后收集细胞培养上清,ELISA检测IFN-γ水平。结果显示:经Levene检验方差不齐,F=11.444, P=0.001。近似F检验Welch法显示F=8320.55, v=3,P=0.000,多重比较结果显示:(M-MDSCs:Splenocytes)为(1:2)组与不加 M-MDSCs组相比,IFN-γ 水平显著降低(P=0.000)。且(MDSCs:Splenocytes)为(1:1)组与不加MDSCs组相比,IFN-γ水平也显著降低(P=0.000)。2.MDSCs分化为OCs的研究2.1 体外诱导 CD11b+Gr-1+ MDSCs 分化为 OCsTRAP染色后,光镜下观察可见,OCs体积较大,形态不规则,胞浆呈酒红色不均匀沉淀,可见大量圆形嗜酸性颗粒,胞核数量多。经过苏木素复染,胞核则呈深黑色。CIA小鼠CD11b+Gr-1+MDSCs诱导分化为OCs细胞数(27.00±2.00)显著高于对照组(8.33±1.53),差异具有统计学意义(t=-12.85, P=0.000)。2.2体外诱导MDSCs亚群G-MDSCs和M-MDSCs分化为OCs免疫4周,流式细胞术分选CIA小鼠脾G-MDSCs和M-MDSCs,用上述方法诱导培养结束后进行TRAP染色,结果表明CIA小鼠M-MDSCs诱导分化为OCs(13.00±1.00)/视野,而G-MDSCs未见OCs分化。流式细胞术分选CIA小鼠脾 G-MDSCs 和 M-MDSCs 纯度分别为 99.2%、98.6%。2.3骨吸收陷窝检测随后,分析MDSCs、G-MDSCs和M-MDSCs是否能分化为功能性的OCs,MDSCs、G-MDSCs和M-MDSCs诱导培养结束后,去除细胞,空气干燥后,显微镜下观察骨吸收陷窝面积,发现CIA小鼠MDSCs骨吸收陷窝面积高于对照组,差异具有统计学意义(t=-3.99, P=0.003)。CIA小鼠G-MDSCs组未见骨吸收陷窝,而M-MDSCs组可观察到大量骨吸收陷窝。3.青藤碱对CIA小鼠MDSCs的干预研究3.1 SIN 干预后 CIA 小鼠 PB、SP MDSCs 水平及 SP G-MDSCs 和 M-MDSCs 水平与对照组相比,SIN干预后PB、SP MDSCs水平下降,差异具有统计学意义( =9.87 和 4.23,P0.001 和 0.05)。SIN干预后SP G-MDSCs水平与对照组相比,差异无统计学意义(t=2.40,P0.05)。而SP M-MDSCs水平降低,差异具有统计学意义(t=3.24, P0.05)。3.2SIN对CIA小鼠关节炎症及骨破坏的影响3.2.1 SIN对CIA小鼠关节炎评分影响造模后约d21出现关节炎症状,后足首先出现红肿,初次免疫后35天红肿及多关节炎病变达高峰。于初次免疫后的第35天每日给予SIN100mg/kg灌胃,至观察结束。d35和d38时,SIN干预组与对照组相比,关节炎评分无差异(P=0.90和P=0.16); d41时,与对照组相比,SIN干预组显著降低关节炎评分(P=0.01)。SIN干预组,d35与d38、d38与d41之间关节炎评分无差异(P=0.51和P:=0.10),而d35与d41之间关节炎评分显著降低(P=0.04)。本资料满足球形假设,W=0.939,P=0.754。重复因素3个不同水平间差异有显著性意义(P0.001),时间和分组之间存在交互作用(P=0.001)。多重比较的结果表明:d35与d38,关节炎评分无显著性差异(P=0.063); d35与d41、d38与d41之间关节炎评分显著降低(P=0.000、0.004)。3.2.2 SIN对CIA小鼠关节病理的影响SIN干预后,显著降低关节病理评分,关节炎性细胞的浸润、软骨破坏及骨侵蚀改善均优于对照组,差异具有统计学意义(t=3.80、5.58和6.33,P均0.05)。3.3 SIN干预后IL-1β、IL-6、(COX-2、TTRAP、CTR和MMP-9mRNA的表达与对照组相比,SIN干预后,脾细胞IL-1β、IL-6、COX-2、TRAP、CTR和MMP-9 mRNA的表达水平均下降。结论1 .CIA小鼠体内大量聚集的CD1 1b+Gr-1+MDSCs及亚群G-MDSCs(CD11b+tLy6G+Ly6Clow)和M-MDSCs(DD11b+Ly6G-LG6IChi)可能参与了其发病过程。2.SPMDSCs不表达F4/80、CD80、CD11c和MHC-Ⅱ,表明这群细胞是非成熟的或未分化的髓系细胞;然而表达了炎症性单核细胞的标记,如CD1115、CCR2和 CD62L。3.CIA小鼠PB、SP和BM CD11b+Gr-1+ MDSCs表达更高水平的CD51,提示CIA小鼠体内CD11b+Gr-1+MDSCs可能是一个新的OCPs。4.MDSCs和M-MDSCs均可抑制T细胞的增殖,降低细胞培养上清中IFN-γ的水平,提示CIA小鼠MDSCs具有免疫抑制功能,而对T细胞的抑制功能不足,可能影响CIA的发病。5.MDSCs特别是M-MDSCs在体外可诱导分化为功能性的OCs,证实了 OCs新的来源。6.SIN可能通过减少MDSCs及亚群M-MDSCs的聚集,进而减轻CIA的严重程度。7.SIN 可能通过降低 IL-1β、IL-6、COX-2 和 MMP-9、CTR 和 TRAP mRNA 的表达,减少MDSCs及亚群M-MDSCs的富集,从而减少OCs的形成,减轻CIA骨破坏。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R593.22

【参考文献】