椎体自身免疫反应动物模型的建立及其相关危险因素的实验研究

发布时间：2018-10-25 11:24

【摘要】：第一部分Modic改变相关危险因素及其分布特点的临床研究目的:探讨腰椎Modic改变发病相关危险因素及其分布特点。方法:回顾性分析自2011年7月至2016年9月在天津市天津医院脊柱外科因腰痛而就诊的患者影像以及相关临床资料。通过磁共振成像(MRI)以及X线对所有患者进行评价,记录患者Modic改变的出现情况、椎间盘退变程度、椎间盘退变或疝出情况、是否存在HIZ现象、是否存在许莫氏结节、有无椎体后缘骨软骨病以及有无出现椎体滑脱等;通过标准化问卷收集患者的个人生活资料信息,包括性别、年龄、身高、体重、工作量、驾车量、吸烟量、运动量、腰痛的强度、频率等病史信息,并分析这些危险因素与Modic改变发病率之间的相关性。结果:全部患者中男性患者324人,女性297人,平均年龄52.5±14.9岁。Modic改变的总体发病率27.5%(n=171),最常见的发病节段为L5/S1(46.2%)。单因素回归分析发现患者的年龄、性别、BMI指数、吸烟情况、工作量、椎间盘退变、椎间盘疝出以及椎体后缘骨软骨病等危险因素均与Modic改变密切相关。Modic改变患者的腰痛程度更剧烈,其病程也相对较长。此外,几乎所有出现Modic改变患者的椎间盘均存在着不同程度的退行性改变。结论:Modic改变与腰痛的程度以及时间存在着相关性,多种生活以及临床危险因素(年龄、性别、BMI指数、吸烟情况、工作量、椎间盘退变、椎间盘疝出以及椎体后缘骨软骨病)均有可能影响Modic改变的发病率。第二部分椎体下自身免疫反应动物模型的建立目的:研究使用针头沿鼠尾方向纵行穿刺,破坏椎间盘使髓核向上或向下突出入椎体的方法建立大鼠动物模型的可行性,并通过影像学观察、组织学分析等方法来验证该模型的可靠性。方法:使用计算机随机数法将24只大鼠(Sprague-Dawley,SD)平均分为3组,分别为实验组、假手术组及对照组。使用针头沿鼠尾方向对实验组大鼠行纵行穿刺,破坏椎间盘使髓核接触到循环系统;假手术组使用针头沿鼠尾方向横行穿刺,仅行椎体破坏,保留椎间盘及髓核的完整;对照组则不进行穿刺。自完成动物造模后4周起,每隔2周使用电子称测量并记录各组实验动物体重,比较各造模组大鼠的体重变化,明确手术对大鼠一般情况的影响。术后4周、8周和12周行MRI检测明确造模效果后处分批处死各组大鼠,取造模部位的尾椎椎体行组织学观察,观察信号变化与组织学改变之间的联系。结果:X-ray定位显示:16G针头能够准确地纵向穿透大鼠尾椎穿透4段椎体及相邻3个椎间盘,针头穿刺后位于尾椎椎体的中央。大鼠造模后体重变化显示:自实验4周起,实验组大鼠的体重逐渐下降,而假手术组和对照组的体重则呈相反的趋势。在实验后的4周、8周和12周,MRI显示实验组大鼠椎体近终板处可见明显的高信号变化,其信号变化在T1WI及T2WI上均可出现,而对照组和假手术组则未在观测到显著的信号变化。病理学染色结果显示实验组大鼠骨小梁结构紊乱,骨及软骨细胞数量随着造模时间的增长逐渐减少,而对照组和假手术组的骨小梁则未见明显变化。结论:大鼠尾椎椎体纵向穿刺法可以建立椎体下自身免疫反应动物模型,髓核接触到循环系统后对大鼠的体重、骨骼条件以及影像学变化均产生了一定的影响。第三部分骨免疫因素在椎体下自身免疫反应动物模型中的影响目的:利用已建立成功的大鼠椎体下自身免疫反应动物模型,通过生物力学、Micro-CT、Elisa、RT-PCR及Western-blot等实验技术分析骨免疫因素在椎体下自身免疫反应动物模型中的影响,揭示Modic改变的发病机制。方法:使用计算机随机数法将72只大鼠(Sprague-Dawley,SD)平均分为3组,分别为实验组、假手术组及对照组。使用针头沿实验组鼠尾方向纵行穿刺,破坏椎间盘使髓核接触到循环系统;假手术组使用针头沿鼠尾方向横行穿刺,仅行椎体破坏,保留椎间盘及髓核的完整,对照组则不进行穿刺。全部实验动物于造模术后的4周、8周、12周行核磁共振检查及骨密度,明确造模效果。待影像学及骨密度检测完毕后,将各组大鼠按实验计划使用10%水合氯醛进行麻醉。待麻醉满意后,按计划对各组大鼠进行取材,具体步骤如下:(1)首先经大鼠腹主动脉抽取5-6ml全血至促凝管中,后在室温中静置2小时,3000 rpm离心15分钟,取上清分装后保存至-80℃冰箱中备用。(2)将大鼠尾部离断后,使用无菌尖刀分别获取造模各节尾椎,逐层剥离尾椎各层肌肉、韧带及骨膜,其中第Co7椎体在离体后,迅速置入RNA保护液中,4℃冰箱静置过夜后转入液氮罐以用于实时荧光定量PCR;Co8离体后则直接保存于液氮中,用于免疫蛋白印迹检测;(3)将第Co9椎体离体后使用0.9%Nacl纱布包裹,后放置-20°C冰箱保存,以用于生物力学测试;(4)将第Co10椎体离体后置于4%多聚甲醛中固定保存,用于Micro-CT分析。结果:Micro-CT结果显示:与对照组相对比,实验组及假手术组大鼠造模4周后,尾椎椎体的骨小梁均出现明显变细,骨小梁结构紊乱且孔隙率显著增大,局部甚至可见椎体骨小梁部分断裂或消失,但实验组动物变化更为明显,可见显著椎体骨质疏松。造模8周后,假手术组大鼠椎体骨小梁厚度逐渐恢复,紊乱的骨小梁结构已基本正常;而实验组大鼠椎体骨小梁则进一步变细,骨小梁结构及孔隙率进一步增大,骨小梁部分断裂和消失的程度较前更为明显。造模12周后,假手术组大鼠椎体骨小梁已基本恢复,与对照组相比未见明显异常;而实验组大鼠椎体骨小梁则出现了更为严重的骨质疏松表现。力学测试结果显示:与对照组相对比,实验组大鼠在造模4周后,其尾椎椎体的生物力学性能均呈显著下降趋势,而与假手术组(S)相比,虽然实验组的各项指标均有所下降,但其差异未见显著统计学意义;造模8周后,假手术组大鼠尾椎椎体的力学性能逐渐恢复,各项指标均接近对照组的数值。而与对照组相比,实验组大鼠尾椎椎体的生物力学性能则呈继续下降的趋势。造模12周后,假手术组大鼠尾椎椎体的力学性能继续恢复,3项测试指标均接近对照组,但仍未恢复至对照组的水平;而实验组大鼠尾椎椎体的生物力学性能则继续下降到低值。Western blot的结果显示:破坏性因素如Rank、Rankl、TNF-α、IL-17及IL-1b等指标在实验组呈明显的高表达状态,且随着造模时间的增长,其表达量逐步升高。与对照组及假手术组相比较,差异具有统计学意义(p0.05);而保护性因素OPG及IFN-γ的指标的表达量则明显受到抑制,与其他两组相比,其差异同样具有统计学意义,而假手术组与对照组间的蛋白表达变化均未见显著的统计学差异。ELISA测试结果显示:与对照组及假手术组相对比,实验组大鼠在造模4周后血清中TNF-α、IL-17及IL-1b的水平均呈显著提高的趋势,其组间差异具有统计学意义(p0.05)。假手术组血清中TNF-α、IL-17及IL-1b的含量虽然有所升高,但差异量相对较小,经过统计分析后发现该组间差异无统计学意义(p0.05)。造模8周后,实验组大鼠血清中TNF-α、IL-17及IL-1b的水平持续升高,其差异较其他两组具有统计学意义(p0.05)。而假手术组在第8周时血清中TNF-α、IL-17及IL-1b的含量则持续降低,逐步接近对照组的水平。造模12周后,实验组大鼠血清中TNF-α、IL-17及IL-1b的水平继续升高,其数值明显高于其他两组大鼠,差异具有统计学意义(p0.05)。而假手术组在第12周时血清中TNF-α、IL-17及IL-1b的含量则基本达到了对照组的水平。RT-PCR结果显示:大鼠造模4周后,与对照组及假手术组相比,实验组大鼠尾椎椎体中Rank、Rankl、TNF-α、IL-17及IL-1b的m RNA表达量显著提高,而OPG及IFN-γ的RNA表达量则显著降低,其各组间差异有统计学意义(p0.05)。假手术组与对照组相比较,其大鼠尾椎椎体中Rank、Rankl、TNF-α、IL-17及IL-1b的m RNA表达量虽然也出现了升高的趋势,但其差异未见显著统计学意义(p0.05)。大鼠造模8周后,与对照组及假手术组相比,实验组大鼠尾椎椎体中Rank、Rankl、TNF-α、IL-17及IL-1b的m RNA表达量继续升高。而OPG及IFN-γ的RNA表达量则持续下降,其各组间差异有统计学意义(p0.05)。造模8周后假手术组与对照组在上述指标上未见明显差异(p0.05)。大鼠造模12周后,与对照组及假手术组相比,实验组大鼠尾椎椎体中Rank、Rankl、TNF-α、IL-17及IL-1b的m RNA表达量仍然处于高值水平升高,而OPG及IFN-γ的RNA表达量则继续下降,其各组间差异有统计学意义(p0.05)。造模12周后,假手术组在Rank、Rankl、TNF-α、IL-17、IL-1b、OPG及IFN-γ的m RNA表达量上与对照组相比未见明显差异(p0.05)。结论:骨免疫因素在大鼠椎体下自身免疫反应动物模型的病理变化中发挥了重要的作用,可能是导致局部信号及骨质变化的原因之一。
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【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R681.5;R-332

【参考文献】