全身麻醉药物选择性诱导脑内神经元细胞发生凋亡

发布时间：2018-11-05 19:00

【摘要】：背景：每年都有数百万的病人在实施全身麻醉的情况下,完成外科手术以及伴有疼痛刺激的医学检查操作。但是,近年来人们不断地在新生动物模型中观察到：全身麻醉能诱导出广泛的脑神经元细胞凋亡,同时伴随脑功能的长期性损害。且人类流行病学研究的结果也表明：曾在3岁以内接受过麻醉处理的小儿,在10岁时与同龄未接受过麻醉的儿童相比,存在发生语言、抽象推理缺陷以及学习障碍的高风险。目前越来越多的关注集中到全麻药物脑神经毒性的研究上,尤其是对于那些脑发育处于高峰期而又需要接受外科手术治疗的早产儿、新生儿、婴幼儿和胎儿,全身麻醉药物在这些患儿中的安全应用问题引起了广大儿科临床医师、政府卫生部门的密切关注和担忧。并且已有的研究结果又提出了很多亟待解决的问题,如：为什么一些脑部区域相对于其它的脑区,神经元细胞凋亡的程度更严重?为什么一些神经元细胞发生了凋亡,而与其毗邻的神经元细胞看上去(形态学方法观察)似乎没有受到任何影响?为什么成年动物的大脑相较于新生动物的大脑,表现出对麻醉药脑毒性作用的不敏感?虽然全麻药物的脑神经毒性作用机制并不清楚,但是了解全身麻醉后脑神经元细胞凋亡的区域分布模式,即全麻药物脑神经毒性的易感区域选择性,这一点对于回答前面所提出的问题、解释现象背后的发生机制至关重要。方法：第一部分全身麻醉药物的脑神经毒性具有依赖于年龄的区域选泽性新生期(P7)、青春期(P21)、成年期(P49)小鼠被随机分入相应年龄组的麻醉组和无麻醉组。其中麻醉组(Anaesthesia)禁食、持续吸入1.5% Isoflurane(异氟烷)和[30% Oxygen (氧气)+70% Nitrogen(氮气)]的混合气体6小时。而与此同时,无麻醉组(No Anaesthesia)、鼠吸入空气并同时禁食6小时。所有麻醉组和无麻醉组的小鼠均予以腹膜内注射ketamine(20mg/kg)+acepromazine (0.5mg/kg)+xylazine (1 mg/kg)处死。即刻经左心室灌注含5% glycerol和5% su crose的冰冷PBS缓冲液；待自右心耳流出的血液转变为澄清的灌洗液后,再用含5%glycerol和5% sucrose的冰冷4%PFA(低聚甲醛)经心脏灌注。取出小鼠脑组织,用4%PFA固定,并制作脑组织冰冻切片。运用细胞凋亡标记物-Cleaved Caspase-3(AC3),对(1)DG—齿状回的颗粒细胞下层-颗粒细胞层、(2)CAl—海马CA1区的锥体细胞层、(3)RSA--大脑皮层RSA区的第2/3层、(4)CPu—纹状体的caudoputamen区、(5)GrO—嗅球的颗粒细胞层、(6)Cb—小脑皮层、(7)Cbwm-小脑白质,共7个脑内区域行凋亡神经元细胞的定量分析；并在同一年龄组内,同一脑部区域,比较麻醉组与无麻醉组之间凋亡神经元细胞密度(AC3+/mm3)是否存在差异以及差异有无统计学意义。第二部分全身麻醉药物的脑神经毒性具有依赖于神经元细胞年龄的选择性在不同年龄点接受腹膜内注射BrdU来标记脑内海马齿状回新生颗粒神经元细胞的小鼠以及未接受BrdU注射的小鼠(应用免疫组织化学染色方法标记不同成熟阶段的海马齿状回颗粒神经元细胞)、在出生后21天(P21)时,给予禁食、持续吸入1.5%Isoflurane(异氟烷)和[30% Oxygen (氧气)+70% Nitrogen (氮气)]的混合气体6小时。然后予以腹膜内注射ketamine (20 mg/kg)+acepromazine (0.5mg/kg)+xylazine(1 mg/kg)处死。即刻经左心室灌注含5%glycerol和5%sucrose的冰冷PBS缓冲液；待自右心耳流出的血液转变为澄清的灌洗液后,再用含5%glycerol和5%sucrose的冰冷4%PFA(低聚甲醛)经心脏灌注。取出小鼠脑组织,用4%PFA固定,制作脑组织冰冻切片和行免疫荧光组织化学染色。所应用的代表海马齿状回颗粒神经元细胞不同成熟阶段的标记物包括：①标记早期神经祖细胞(early progenitors)的Sox2；②标记晚期神经祖细胞(late progenitors)的NeuroD1;③标记不成熟颗粒神经元细胞(immature granule cells) 的 calretinin;④标记成熟颗粒神经元细胞(mature granule cells)的calbindin。再与细胞凋亡标记物-Cleaved Caspase3 (AC3,效应子Caspase 3)相结合,行以下定量分析：①计算出所有BrdU+细胞中BrdU+/AC3+共免疫染色阳性细胞所占的比例,即(BrdU+-AC3+) /BrdU+比值。②计算出各总AC3+细胞中每一种成熟标记物免疫染色阳性的细胞所占的比例,即(Sox2+-AC3+)/AC3+比值,(NeuroD1+-AC3+)/AC3+比值,(calretinin+-AC3+)/AC3+比值,(calbindin+-AC3+)/AC3+比值。以上来证实脑内神经元细胞对于全麻诱导凋亡这一毒性作用存在着一个特殊的神经元细胞年龄的易感窗。结果：第一部分全身麻醉药物的脑神经毒性具有依赖于年龄的区域选择性与无麻醉组相比,麻醉组中的P7小鼠在以下脑部区域的凋亡神经元细胞数量发生了具有统计学意义的增高：RSA区(11倍),CPu区(10倍),CA1区(3倍),Cb区(4倍)及GrO区(4倍)。更重要的发现是：标志神经元细胞凋亡的AC3阳性细胞计数,在P21小鼠及P49小鼠的DG和GrO区仍保持具有统计学意义的增高,分别为P21小鼠(15倍和12倍),P49小鼠(2倍和4倍)。第二部分全身麻醉药物的脑神经毒性具有依赖于神经元细胞年龄的选择性证实当神经元细胞的年龄在13天-15天时表现出对全麻药物脑神经毒性最高的敏感性,而随后凋亡神经元数量就大幅减少。同时运用海马齿状回(DG)内颗粒神经元细胞处于不同成熟阶段的标记物：早期神经祖细胞Sox2、晚期神经祖细胞NeuroD1、不成熟颗粒神经元细胞calretinin、成熟颗粒神经元细胞calbindin行定量分析,证实晚期神经祖细胞(NeuroD1)口不成熟颗粒神经元细胞(calretinin),对持续6h吸入1.5% Isoflurane(异氟烷)诱导神经元细胞凋亡的神经毒性作用最敏感,而早期神经祖细胞和成熟的颗粒神经元细胞未受到明显影响。结论：该研究在肯定了既往有关新生动物前脑对全身麻醉药物脑神经毒性作用的高度易感性的基础上,进一步发现这种易感性可以延续至成年动物,但是仅局限于能持续神经发生的DG(海马齿状回)和GrO(嗅球颗粒细胞层)区。全身麻醉药物引发的脑神经元细胞凋亡是具有一定选择性的。首先,全身麻醉药物引发的脑神经元细胞凋亡是具有依赖于麻醉时动物年龄的区域选择性的。麻醉诱导脑内神经元细胞广泛性凋亡的易感时间窗,是在脑内不同区域各自的神经发生高峰时间窗后的1周～2周。其次,全麻药物脑神经毒性选择性不仅仅是简单地由动物的年龄决定,而且是更精确的是取决于麻醉时,神经元细胞的年龄以及其成熟状态。在海马齿状回,不成熟的颗粒神经元细胞且年龄在13天-15天时表现出对全麻药物脑神经毒性作用最高的易感性。
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【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R726.1

【参考文献】