力竭游泳应激致大鼠心肌损伤的实验研究

发布时间：2018-11-09 08:59

【摘要】：背景应激是指个体面临或察觉(认知、评价)到环境变化(应激原)对机体有威胁或挑战时做出的适应和应对的过程。适度的应激能够活化思维、提高人们的警觉性和工作效率,但超过个体承受能力的应激压力,则往往会诱发多种疾病。心脏是应激作用的主要靶器官之一,多种心脏疾病的发生和发展与应激机制的激活密切相关。运动是一种特殊的应激,适宜的运动能够提高心脏的功能,如心肌纤维增粗、收缩力增强等,而力竭运动或过度训练则对心脏具有消极作用,不仅不利于心脏功能的提高,还会使心肌受到损伤,使心脏发生病理性改变,生活中经常遇到的猝死现象就证明了这一点。有研究表明过度训练引起的心肌损伤(overtraining-induced acute myocardial injury, OTIAMI)是猝死的重要原因之一,目前还没有效的防治措施。因此,如何进一步认识OTIAMI的发病机理,探索其防治措施是当今运动医学、临床医学和军事医学面临的重大课题。 N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)是一种经典的抗氧化剂和自由基清除剂,可以有效得提高心脏谷胱甘肽的含量,阻止高血压时高浓度的TNF-α对心脏的毒害作用。同时谷胱甘肽还能够通过改善心肌氧化还原状态抑制NF-κB的激活,使肥大的心脏得到复原,从而改善高血压心脏重构,提高重构心脏的收缩力。大鼠心肌缺血再灌注实验表明NAC能明显降低血清心肌肌钙蛋白I (cardiac troponin I, cTnI)和脂质过氧化物(lipid peroxidation, LPO)的水平,显著缩小心肌梗死面积。也有研究证实NAC可通过抑制诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)的表达,进而抑制NF-κB的活性,导致其下游细胞因子减少,通过TLR4/NF-κB途径降低心肌细胞凋亡率,从而起到心肌保护效应。不仅如此,NAC预处理还可明显减少细胞活性氧(reactive oxygen species, ROS)的产生,减轻细胞线粒体膜电位的崩溃及caspase的活化。然而,NAC对OTIAMI是否具有防治作用及其作用机制尚不清楚。本课题通过反复游泳力竭应激建立过度训练致心肌损伤动物模型,研究细胞色素c (cytochrome c, CytC)、程序性细胞凋亡因子5(programmed cell death5, PDCD5)和心肌损伤的关系,观察力竭游泳应激对心肌的影响及NAC对OTIAMI是否具有防治作用,为进一步认识OTIAMI的发病机制及防治提供新的理论基础和实验依据。方法 1.动物分组及模型建立：36只雄性Wistar大鼠,4-5周龄,体质量(110±20)g,购回后,适应性游泳2次,每日1次每次20min,剔除异常鼠。次日进行正式实验,称重后,随机分为3组：对照组(C组)、应激组(S组)和应激+NAC干预组(N组),每组12只。N组每天用NAC150mg/kg灌胃,每日1次,连续7周,其他组给予等量的双蒸水。灌胃30min后负5%体重自制重物进行力竭游泳训练(C组不运动)。力竭标准：大鼠游泳动作协调性明显下降,水淹没鼻,沉入水中10s不能浮出水面连续3次,且捞出后放在平面无法迅速完成翻正反射者。游泳条件：SLY-WMS水迷宫,内壁光滑,直径1.2m,深0.5m,没有平台,带自动时间和温控装置,实验时设置水深45cm,水温(30±2)℃,大鼠不能逃离,不能触底。 2.取材：每组于实验结束后即刻取材。10%水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉,仰卧位固定,四肢插入心电电极,用Power-lab记录仪和1050.1型压力换能器连续记录5分钟心率、ECG变化,观察心律失常的发生情况。术野备皮消毒,颈部正中切开,行气管切开后插入16G套管针,连接呼吸机行人工呼吸,不连接氧气装置。胸骨下段纵切口,以血管钳经剑突下探人胸骨后,钝性分离后将胸骨正中劈开至第三前肋旁,缝扎胸骨止血。将22G套管针沿心脏长轴方向刺人心尖约3mm,连接测压装置,动态观察左心室压变化。记录完成后自测压管采血2-3ml,静置1h,3600r/min,4℃离心10min,留取血清-70℃冰箱保存。同时用DEPC水浸泡过的剪刀和镊子小心留取左室游离壁心肌标本,其中部分标本用4%甲醛固定,24h后行常规石蜡包埋,备用；剩余的标本则切成3mm厚的薄片,浸入4℃3%戊二醛固定液中,冲洗脱水后,环氧树脂包埋,用超薄切片机切成50um超薄切片后置入铜网上,用1%-2%醋酸铀和枸橼酸铅染色,透射电镜观察。对照组除不游泳训练外,其他处理方法同实验组,在实验组大鼠处死的同时,处死对照组。 3.各项指标的检测：实验期间每天观察大鼠体重、饮食、运动能力的变化；实验结束后采用Powedab16导生理记录仪记录心率、心电图变化及各项心脏血流动力学指标,比较各组大鼠的左心室收缩压(left ventricular systolic pressure, LVSP)、左心室压上升/下降最大速率(±dp/dtmax)、心脏重量指数和心室重量指数；采用光镜观察心肌病理形态,电镜观察心肌超微结构。T-SOD活性测定采用黄嘌呤氧化酶法,抽提法检测CuZn-SOD、Mn-SOD活性；MDA采用硫化巴比妥酶法测定,心肌组织蛋白含量测定采用考马斯亮兰法。并采用实时荧光定量PCR检测心肌细胞程序性细胞凋亡因子5(programmed cell death5, PDCD5) mRNA表达；Western blot检测心肌细胞胞浆中细胞色素C(CytC)的蛋白表达：酶联免疫法测定血清心肌肌钙蛋白I (TNNI3)和血清肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)的含量。 4统计方法：所有数据均用平均数±标准差表示,样本均数比较用t检验,组间比较用单因素方差分析,P0.05认为有统计学意义。结果 1.一般情况的观察：大鼠游泳训练至第4周时,应激组有1只精疲力尽溺水衰竭,第6周时应激组又有1只出现溺水衰竭。经过7周负重游泳训练后,应激组大鼠神态倦怠,毛发脱落明显,眼睛变得暗淡无光,反应能力明显降低,易受惊吓,同时在运动训练后期,易发生抽搐。对照组大鼠神态安静,皮毛光洁整齐,眼睛有神,反应敏捷,活泼好动。对照组体重增长比应激组快,前3周两组均呈正性增长。但应激组增长较对照组慢,第4周起体重(272.68±16.96g)不再增长,随着力竭游泳应激天数的增加,体重有下降的趋势,与对照组(345.98±23.11g)比较,差异有统计学意义(t=8.603,PO.05)。对照组大鼠在整个实验期内饮食量也呈正性增长。对照组实验后饮食量(36.53±3.02g)比实验前(21.23±1.86g)增长明显,为72.1%(t=31.882,P0.05),而应激组大鼠在实验前3周饮食量呈正性增长,从第4周开始饮食量呈负性增长,实验末饮食量(21.32±2.75g)比实验前(20.89±1.78)仅增加2.1%,变化无统计学差异(t=0.913,P0.05),比实验期最大饮食量(第3周饮食量)(32.15±3.32g)减少33.7%差异有统计学意义(t=29.762,P0.05)。 2.心肌病理及超微结构的变化：光镜观察发现,游泳力竭应激大鼠心肌纤维肿胀肥大、水肿,部分见心肌间血管及毛细血管扩张；应激+NAC干预组心肌纤维轻度肿胀、水肿,偶见心肌间血管及毛细血管扩张；对照组未发现明显异常。不同组别大鼠心尖部组织透射电镜观察：对照组大鼠心肌超微结构正常,肌节排列整齐,Z线、M线、I带、A带清晰;线粒体呈带状分布,排列整齐,形态正常；血管管腔光滑,基底膜正常。应激+NAC干预组大鼠大部分心肌纤维结构未见明显异常,明暗带清楚,仅个别线粒体肿胀。力竭游泳应激后大鼠心肌组织结构完整度破坏,大部分肌丝溶解,Z线明显增粗向I带延伸；心肌细胞核明显水肿,肌纤维基质水肿；线粒体内形成许多同心圆状结晶,肿胀明显,有的基质溶解呈空泡结构,核膜还基本完整。 3.血清CK-MB及TNNI3含量的变化：本实验三组大鼠血清CK-MB和TNNI3值统计分析采用单因素方差分析,差异均有统计学意义(CK-MB:F=429.183, df=2, P0.05; TNNI3: F=257.953, df=2, P0.05)。进一步多重比较采用LSD法：与C组CK-MB (8.866±0.950)pg/ml、TNNI3(84.854±11.574)pg/ml比较,S组血清CK-MB(19.343±0.944) pg/ml、TNNI3(198.107±12.060) pg/ml水平明显升高,差异有统计学意义(P0.05)；与S组CK-MB (19.343±0.944) pg/ml、TNNI3(198.107±12.060) pg/ml相比,N组血清CK-MB (11.998±0.634) pg/ml、TNNI3(128.265±11.489) pg/ml水平明显下降,差异有统计学意义(PO.05),但仍高于对照组C组CK-MB (8.866±0.950) pg/ml、 TNNI3(84.854±11.574) pg/ml (P0.05)。 4.三组大鼠心肌组织T-SOD、CuZn-SOD、Mn-SOD活性及MDA含量的比较：本组整体而言组间均数差异均有统计学意义(T-SOD:F=130.739, df=2,P0.05; CuZn-SOD: F=65.098, df=2,P0.05; Mn-SOD:F=43.234, df=2,P0.05; MDA:F=43.703, df=2, P0.05),两两比较采用LSD法：与C组(T-SOD:160.638±9.419U/mgprot, CuZn-SOD:118.724±7.187U/mgprot,Mn-SOD:41.915±7.508U/mgprot)比较,S组大鼠心肌组织的各超氧化物歧化酶活性明显降低(T-SOD:126.435±6.368U/mgprot, CuZn-SOD:96.809±4.998U/mgprot,Mn-SOD:29.626±8.595U/mgprot),差异有统计学意义(P0.05)；与S组比较,N组大鼠心肌组织的各超氧化物歧化酶活性明显升高(T-SOD:197.619±13.334U/mgprot,CuZn-SOD:137.345±11.042U/mgprot, Mn-SOD:60.274±7.426U/mgprot)(P0.05),并且高于C组,差异有统计学意义(PO.05)。与C组(1.343±0.104nmol/mgprot)相比,S组大鼠心肌组织的MDA含量显著升高(1.913±0.206nmol/mgprot),差异有统计学意义(P0.05)；与S组比较,N组大鼠心肌组织的MDA含量显著降低(1.407±0.144nmol/mgprot)(P0.05),虽然仍高于C组,但差异无统计学意义(P0.05)。 5.各组心肌组织CytC蛋白及PDCD5mRNA的表达结果：本组整体而言组间均数差异有统计学意义(CytC:F=79.497, df=2, P0.05; PDCD5mRNA:F=73.290, df=2, P0.05),具体如下所述。心肌组织CytC蛋白的表达：两组间目的蛋白条带与同一样品GAPDH的比值进行比较,Western blot结果显示：与C组比较,S组和N组CytC蛋白的表达量均增高(0.485±0.161；0.381±0.326VS0.327±0.120),差异有统计学意义(P0.05)；给予NAC干预后,N组CytC蛋白的表达(0.381±0.326)较S组(0.485±0.161)明显降低,差异有统计学意义(P0.05)；但仍高于对照组C,差异有统计学意义(P0.05,)。各组心肌组织PDCD5mRNA的表达：所有检测目的基因溶解曲线均为单峰,产物特异性良好。对PDCD5mRNA的表达量采用2-AACT法进行评估,与C组相比较,S组和N组PDCD5mRNA的表达均增高(2.297±0.098；1.739±0.065VS1.060±0.065),差异有统计学意义(P0.05)：给予NAC干预后,N组PDCD5mRNA的表达(1.739±0.065)较S组(2.297±0.098)明显降低,差异有统计学意义(P0.05)；但仍高于对照组C,差异有统计学意义。结论 1.本研究所采用的“强迫游泳+负重”动物模型出现了明显的食欲减退、体重减轻及反应低下等改变,在心肌组织中也出现了明显的病理改变,说明我们所采用的实验动物模型是成功的,可用于对OTIAMI的研究。 2.长期力竭游泳应激会使心脏产生一系列病理及功能的改变,造成运动性心脏超负荷,破坏心肌局部组织结构,最终导致心肌损伤。 3.NAC对OTIAMI具有防治的效果,可以通过其抗氧化作用来减轻大鼠心肌过度训练所致的过氧化损伤。 4.NAC能够下调力竭游泳应激后大鼠心肌细胞PDCD5mRNA的表达,抑制CytC从线粒体向胞浆释放,从而达到心肌保护的作用。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R542.2

【参考文献】