1型糖尿病对去势大鼠骨改建的影响及机制研究

发布时间：2018-11-11 16:24

【摘要】：研究背景：骨质疏松症(Osteoporosis, OP)作为一种系统性骨病一直被众多科研工作者和临床医务人员所关注,其主要表现为骨量减少,骨脆性增加以及骨折。随着我国乃至世界范围内人口老龄化的到来,包括绝经后骨质疏松症在内的原发性骨质疏松症已经成为一个亟待解决的医疗问题和社会问题。另外,一些其他因素如全身性疾病引发的继发性骨质疏松症也严重威胁着人类的健康。其中,糖尿病性骨质疏松症因骨质破坏严重、骨折并发率高等特征,受到越来越多国内外学者的关注。近年来,绝经后骨质疏松症患者糖尿病发病率正在逐年升高,绝经后骨质疏松症患者并发糖尿病后的骨质改变及其相关机制的进一步阐明将为如何提高老年妇女的生活质量提供有意义的理论依据。目的：本研究拟通过建立单纯绝经后骨质疏松症、单纯1型糖尿病性骨质疏松症及伴发1型糖尿病的绝经后骨质疏松症的实验动物模型,系统评价1型糖尿病对去势模拟的绝经后骨质疏松大鼠骨改建的影响并探讨相关机制,以期为骨质疏松症的临床干预和治疗提供理论支撑。方法：第一部分：8周龄雌性Wistar大鼠40只,随机分为对照组(BC组),去势组(ED组),1型糖尿病组(DM组),去势合并1型糖尿病组(ED+DM组),每组10只。ED和ED+DM组切除双侧卵巢,建立绝经后骨质疏松症大鼠模型。4周后对DM组和ED+DM组大鼠一次性腹腔注射链脲佐菌素(1% STZ,pH4.5, 50mg/kg),分别建立1型糖尿病骨质疏松症和伴发1型糖尿病的绝经后骨质疏松症大鼠模型。各组大鼠达21周龄时,每组随机选择5只大鼠脱颈处死,分离双侧胫骨,经4%多聚甲醛液外固定、PBS冲洗、组织修剪等一系列步骤后,将胫骨沿其长轴方向排列并固定,置入Micro CT中进行扫描。扫描参数：扫描电压80kVp,电流500μA,分辨率10μm,曝光时间2500ms。选取距胫骨生长板远端1.0mm,厚度1.0mm松质骨为感兴趣区域(ROD,应用Micro CT自带的Inveon Research Workplace 2.2软件进行三维重建。应用软件分析ROI区域的骨体积分数(BV/TV,%),骨小梁厚度(Tb.Th,μm),骨小梁数量(Tb.N,1/mm),骨小梁分离度(Tb.Sp,μm),骨小梁模式因子(Tb.Pf,1/mm)及骨密度(BMD, mg/cm3)。第二部分：动物模型及分组情况同第一部分,各组大鼠达21周龄时,每组选择5只大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉,4%多聚甲醛液进行心脏内灌注固定,分离大鼠双侧股骨和胫骨,经过固定、脱钙、脱水、透明、浸蜡、包埋等一系列步骤后,制备长骨冠状向5μm连续切片。对切片行HE染色评价组织学形态,免疫组织化学染色和酶化学染色检测成骨相关因子(ALP)和破骨相关因子(TRAP、CK)的表达情况。每个标本选择10张切片,每个切片选择3个不同的视野应用IPP软件进行破骨细胞计数和免疫染色强度分析。第三部分：动物模型及分组情况同第一部分,大鼠脱颈处死后,分离股骨,采用Trizol法提取股骨组织中的总RNA,逆转录合成cDNA后进行荧光定量PCR扩增。分别检测Wnt/β-catenin (LRP5、β-catenin、Runx2)和NF-κB(RANKL、 OPG, RANKL/OPG、TRAF6、NF-κB)信号通路相关因子的]mRNA相对表达量。结果：第一部分：①大鼠空腹血糖变化情况：STZ注射后,DM组、ED+DM组血糖与时间呈正相关(P0.01),其中ED+DM组略高于DM组,BC组和ED组未见明显变化。②大鼠体重变化情况：ED组体重与时间呈正相关(P0.01),DM组、ED+DM组体重与时间呈负相关(P0.01),BC组未见明显变化。③骨小梁结构参数：同BC组相比,ED、DM、ED+DM组的BV/TV、Tb.Th、Tb.N及BMD均降低(P0.05),其中ED+DM组最低；ED组BV/TV、Tb.N低于DM组,Tb.Th、BMD高于DM组(P0.05)。与BC组比较,ED、ED+DM组的Tb.Sp均升高(P0.05),DM组未见明显差异；ED、DM、ED+DM组Tb.Pf均升高(P0.05),ED+DM组最高,DM组与ED组之间未见明显差异。第二部分：①ALP免疫组织化学染色：四组中ED组ALP表达最强(P0.05),在生长板下方和骨小梁表面可见大量的ALP阳性成骨细胞；ED+DM组最低(P0.05),仅在生长板下方可见极少量的ALP阳性细胞,骨小梁表面几乎不可见；DM组ALP表达强度较ED+DM组略高,仍低于BC组和ED组(P0.05),在生长板下方可见散在的ALP阳性细胞,部分骨小梁表面可见少量ALP阳性成骨细胞。② TRAP阳性破骨细胞计数及CK免疫组织化学染色：与BC组比较,ED组破骨细胞数量最多(P0.05),其破骨细胞不仅胞核多,体积大,而且CK表达强度较高(P0.05)；DM组、ED+DM组TRAP阳性破骨细胞数量较少(P0.05),破骨细胞CK表达强度低(P0.05),细胞体积小,胞核数量少,DM组与ED+DM组的破骨细胞数量及CK表达强度未见明显差异。第三部分：①骨组织Wnt/β-catenin信号通路相关因子mRNA表达：ED组LRP5的表达最高(P0.01), ED+DM组最低(P0.01),BC组和DM组未见明显差异；ED组β-catenin的表达最高(P0.01),DM组和ED+DM组略低,ED+DM组低于DM组(P0.05)；ED组Runx2的表达明显升高(P0.01),DM组和ED+DM组略降低(P0.05),DM组和ED+DM组之间未见差异。②骨组织NF-κB信号通路相关因子mRNA表达：ED组RANKL的表达略升高(P0.05), ED+DM组明显升高(P0.01),DM组未见明显变化；四组OPG的表达均无统计学意义；RANKL/OPG比值与RANKL的表达趋势相同,ED组略升高(P0.05),ED+DM组最高(P0.01),DM组未见明显变化；ED组、DM组、ED+DM组TRAF6的表达均升高(P0.05),其中ED组升高较明显(P0.01),但是ED组、DM组、ED+DM组三组间未见明显差异；ED组NF-κB的表达升高(P0.01),DM组、ED+DM组降低(P0.01),DM组和ED+DM组之间未见明显差异。结论：1、去势与1型糖尿病造成的骨质疏松在骨小梁形态上存在明显差异,前者主要表现为骨小梁数量的减少和缺失；后者则表现为骨小梁厚度明显变细,骨小梁断裂。去势合并1型糖尿病时骨小梁数量明显减少,髓腔空隙明显增加,骨质破坏和丢失程度最为严重。2、在去势引起的骨质疏松模型中,NF-κB和Wnt/β-catenin信号通路均被激活,骨形成和骨吸收活性增强,表现为高转换型骨改建特征,造成骨量丢失。3、单纯1型糖尿病骨质疏松症发生时,NF-κB与Wnt/β-catenin信号通路均下调,骨吸收和骨形成均受到抑制,表现为低转换型骨改建特征,造成骨量丢失。4、1型糖尿病能够将绝经后骨质疏松症的高转换型骨改建逆转为低转换型骨改建,并加速其骨量丢失,其具体作用机制尚有待进一步研究。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.1;R580

【参考文献】