线粒体DNA在髋部骨折后炎症反应中的作用及初步机制探讨

发布时间：2018-11-28 20:09

【摘要】：研究背景及意义：髋部骨折是指从股骨头至小转子以下5cm这一区域内所发生的股骨近端骨折,包括股骨颈骨折、股骨粗隆间骨折和转子下骨折,临床上以股骨颈骨折和股骨粗隆间骨折最为常见,占据了髋部骨折的90%以上。老年人因其特殊的体质及相关基础疾病,成为该病最为广泛的受累群体,其发生率随年龄增长而逐渐上升。现有临床研究资料显示：87%-96%的髋部骨折病人年龄60岁,老年髋部骨折具有很高的致残率(27%-36%)及致死率(2.7%-5.0%)。对于老年髋部骨折的患者,如何获得一个理想的临床转归,这一直是临床工作者的研究热点。现代炎症理论学说认为：创伤可以触发炎症反应,但并不是所有的创伤都可以引发不可控制的全身性炎症反应。因为当创伤触发炎症介质释放时,创伤周围组织及机体系统也会相应的启动和分泌抑炎物质,从而控制创伤诱发的炎症。只有当机体承受创伤超过其耐受能力时,机体内促炎／抑炎平衡被打破,才会诱发系统性炎症反应及多器官功能衰竭。老年患者由于机体生理机能储备下降,从而易诱发创伤性炎症反应,即使是一个轻微的创伤都可能诱发严重的自身破坏性炎症介质释放,而抗炎介质不足以抑制炎症的发展。最近国内外研究表明：老年髋部骨折患者较高的致残率及致死率与创伤后的炎症应激反应有关。因此,探索老年髋部骨折创伤后炎症应激反应的分子机制,寻找新的可能的干预靶点,无疑对降低老年髋部骨折的并发症发生率及死亡率具有重要意义。内共生学说(endosymbiont hypothesis)认为真核细胞是由真核祖细胞吞入噬氧细菌共生进化而来,即细菌被真核生物吞噬后,在长期的共生过程中,相互适应,逐渐演变,形成了线粒体。细菌进化论证实线粒体在形态、染色反应、化学组成、物理性质、活动状态、遗传体系等方面与细菌有非常大的相似性。因此,创伤后组织细胞破裂释放线粒体,线粒体成分通过线粒体损伤相关分子模式(mitochondrial DAMPs, MTDs),激活机体自身固有免疫,促发与脓毒症相似的炎性反应。MTDs包括甲酰肽和线粒体DNA (mitochondrial DNA, mtDNA),其中线粒体DNA可活化细胞内TLR9 (Toll-Like Receptor),促发多条炎性信号传导通路,引起全身性炎性反应,造成远隔器官的损伤(以肺损伤最常见)。大量临床研究表明,肺部感染是老年人髋部骨折最常见的并发症之一,而由肺部感染导致的多器官功能衰竭则是其最常见的死亡原因。髋部骨折创伤及手术打击可引起损伤组织的mtDNA释放,促发炎症反应,从而导致机体免疫功能异常及远隔器官损伤(以肺损伤最常见),这与骨折后肺部感染、脓毒血症及多器官功能衰竭等并发症的发生密切相关。老年人由于衰老所致的免疫代偿能力减弱,在遭受髋部骨折创伤及手术打击时,诱发全身性炎症反应的免疫功能异常及远隔器官损伤的可能性更大,程度往往也更严重,更容易罹患感染性并发症而死亡。目前关于髋部骨折后mtDNA的释放模式及其相关炎症反应机制的研究较少,尚缺乏机制性研究及有效的干预手段,且国内外针对老年群体髋部骨折后自身炎症反应的相关研究仍较罕见,这与目前全球人口老龄化特征不符。因此,探索老年髋部骨折后mtDNA的释放模式及其相关炎症反应的分子机制,寻找新的可能的干预靶点,无疑对降低老年髋部骨折并发症发生率及死亡率具有重要意义。第一章髋部骨折后mtDNA的释放及TLR9/NF-KB通路激活的实验性研究目的(1)观察髋部骨折后mtDNA的释放模式,同时对比老年髋部骨折模型与成年髋部骨折模型之间mtDNA释放模式的差异。(2)研究髋部骨折后mtDNA释放与炎症反应之间的相关性,同时初步探讨髋部骨折后mtDNA释放与炎症TLR9/NF-KB通路之间的相关性。材料与方法(1)40只成年雄性SD大鼠及40只老年雄性SD大鼠分别被随机分成sham组和骨折组。两个骨折组老鼠接受麻醉、插管及骨折操作处理,两个sham组老鼠接受除骨折操作以外的相关处理。各组老鼠分4批,5个／批分别于操作处理结束后8、24、48及72 h处死,取血标本、肺泡灌洗液及肺组织标本。(2)通过肺组织病理切片组织学评分、肺泡灌洗液蛋白含量测定、髓过氧化物酶(MPO)活性和中性白细胞弹性酶(NE)浓度测定评估肺损伤程度,酶联免疫吸附试验法(ELISA)观测血标本及肺泡灌洗液中IL-6和IL-10的浓度,蛋白质印迹法(western blotting)检测磷酸化NF-kB蛋白含量、TLR-9蛋白的含量和NF-kB亚基P65蛋白含量变化。实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测血清mtDNA浓度。(3)应用SPSS20.0统计软件分析数据,计量资料用均数±标准差(x±s)表示,方差齐时,总体均数的比较采用单向方差分析(one-way ANOVA),各组间多重比较采用Bonferroni法；方差不齐时,总体均数的比较采用Welch法,各组间多重比较采用Dunnett's T3检验。两样本均数比较用独立样本t检验,P0.05为具有统计学意义。结果(1)两个骨折组老鼠血清内mtDNA、IL-6和IL-10的浓度在髋部骨折后8、24、48及72 h较对应的sham组均明显升高(P1：老年骨折组vs老年sham组；P2：年轻骨折组vs年轻sham组。除IL-10在72h时P2=0.124外,所有P值均0.05),同时老年骨折组血清内mtDNA、IL-6和IL-10浓度在髋部骨折后四个时间点均显著高于年轻骨折组(除IL-6在8h和48h时P值分别为0.242和0.055外,所有P值均0.05)。(2)两个骨折组老鼠肺泡灌洗液内蛋白含量、IL-6和IL-10的浓度在骨折后8、24、48及72 h较对应的sham组均明显升高(P1：老年骨折组vs老年sham组；P2：年轻骨折组vs年轻sham组。除IL-10在72h时P2=0.340外,所有P值均0.05),同时老年骨折组肺泡灌洗液内蛋白含量、IL-6和IL-10浓度在髋部骨折后四个时间点均显著高于年轻骨折组(所有P值均0.05)。(3)两个骨折组老鼠肺组织病理切片组织学评分、肺组织内MPO活性、NE浓度以及NF-kB及TLR-9蛋白含量在骨折后8、24、48及72 h较对应的sham组均明显升高(所有P值均0.05),同时老年骨折组肺组织病理切片组织学评分、肺组织内MPO活性、NE浓度以及NF-kB及TLR-9蛋白含量在髋部骨折后四个时间点均显著高于年轻骨折组(除8h时MPO的P=0.254外,所有P值均0.05)。(4)与血清IL-6(B=-0.003,P=0.178)和IL-10 (B=0.025,P=0.000)相比较,mtDNA (B=0.965, P=0.000)与肺病理性评分具有更高的相关性。结论(1)髋部骨折可引起mtDNA的释放、系统性炎症及肺损伤。(2)在相同髋部骨折打击下,老年骨折组大鼠较年轻骨折组大鼠遭受了更严重的系统性炎症及肺损伤。(3)髋部骨折后mtDNA的释放以及TLR9/NF-κB通路的激活可能是创伤后系统性炎症及肺损伤的原因。第二章MtDNA活化TLR9/NF-κB通路引发系统性炎症及急性肺损伤的实验性研究目的(1)研究mtDNA与系统性炎症及急性肺损伤之间的相关性。(2)初步探讨mtDNA与炎症TLR9/NF-κB通路在系统性炎症及急性肺损伤病理过程中的作用。材料与方法(1)20只成年雄性SD大鼠及20只老年雄性SD大鼠分别被随机分成sham组和mtDNA组。两个mtDNA组老鼠接受麻醉、插管及mtDNA注射操作处理,两个sham组老鼠接受除mtDNA注射操作以外的相关处理。各组老鼠于操作处理结束后24h处死,取血标本、肺泡灌洗液及肺组织标本。(2)通过肺组织病理切片组织学评分、肺泡灌洗液蛋白含量测定、MPO活性和NE浓度测定评估肺损伤程度,酶联免疫吸附试验法(ELISA)观测血标本及肺泡灌洗液中IL-6和IL-10的浓度,蛋白质印迹法(western blotting)检测TLR-9蛋白和NF-κB亚基P65蛋白的含量变化。(3)应用SPSS20.0统计软件分析数据,计量资料用均数±标准差(x±s)表示,方差齐时,总体均数的比较采用单向方差分析(one-way ANOVA),各组间多重比较采用Bonferroni法；方差不齐时,总体均数的比较采用Welch法,各组间多重比较采用Dunnett's T3检验。两样本均数比较用独立样本t检验,P0.05为具有统计学意义。结果(1)两个mtDNA组老鼠血清内IL-6和IL-10的浓度在mtDNA注射后24h较对应的sham组均明显升高(所有P0.05)。(2)两个mtDNA组老鼠肺泡灌洗液内蛋白含量、IL-6和IL-10的浓度在mtDNA注射后24h较对应的sham组均明显升高(所有P0.05)。(3)两个mtDNA组老鼠肺组织病理评分、肺组织内MPO活性、NE浓度、NF-κB及TLR-9蛋白表达在mtDNA注射后24 h较对应的sham组均明显升高(所有P0.05)。结论血清mtDNA浓度升高可导致系统性炎症及肺损伤,这可能与炎症TLR9/NF-κB通路的激活有关。第三章MtDNA对支气管上皮细胞生理功能的影响目的探讨mtDNA对支气管上皮细胞生理功能的影响。材料与方法使用SD大鼠支气管上皮细胞行培养,待细胞培养构建后分sham组和mtDNA组,将mtDNA加入mtDNA组细胞培养液中干预24h后,使用细胞跨膜电阻(TEER)法检测单层细胞通透性的变化,使用ELISA测定细胞内IL-6和IL-10的表达,Western Blot法检测支气管上皮细胞粘附连接蛋白(E-cadherin, β-catenin)、紧密连接蛋白(Occludin, ZO-1)、TLR-9蛋白和NF-κB亚基P65蛋白的表达水平,细胞免疫荧光法检测支气管上皮细胞连接蛋白(E-cadherin, β-catenin, Occludin和ZO-1)的分布情况。应用SPSS20.0统计软件分析结果数据。结果mtDNA作用支气管上皮细胞24h后,可使上皮细胞TEER显著下降(t=9.016,P=0.001), FITC-右旋糖苷通透性(Pa/Pc)显著增加(t=-4.022,P=0.016), IL-6、IL-10的表达水平增高,NF-κB P65及TLR-9蛋白表达量显著增加,黏附连接蛋白E-cadherin及紧密连接蛋白ZO-1表达水平减少。细胞免疫荧光显示mtDNA可导致细胞膜连接蛋白(E-cadherin, β-catenin, Occludin和ZO-1)的连续性及完整性破坏。结论mtDNA通过改变支气管上皮细胞连接蛋白的分布及表达,破坏肺上皮细胞屏障功能,这与TLR9/NF-κB炎症通路的激活以及IL-6、IL-10的释放有关。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R683

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