针刺百会、足三里穴对脑缺血再灌注损伤大鼠血脑屏障保护作用机制的研究

发布时间：2018-12-27 16:37

【摘要】：研究目的 脑缺血再灌注后血脑屏障通透性增加导致脑水肿,引起脑组织的继发性损伤。本论文探索了线栓法制作大鼠大脑中动脉闭塞脑缺血再灌注模型,并探讨了针刺百会、足三里穴对脑缺血再灌注损伤后血脑屏障破坏的保护作用机制,为针刺治疗缺血性脑血管病的研究提供进一步的科学依据。 实验方法 随机数字表法将健康雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、电针组和药物组。其中后三组根据再灌注时间分为1d、3d、5d和7d组。以右侧大脑中动脉线栓法制备脑缺血再灌注损伤模型,针刺组为造模成功后在规定时间内针刺百会和左足三里穴；药物组为造模成功后腹腔注射依达拉奉。再灌注7d后,各组大鼠麻醉后断头取脑,TTC染色后以Image J计算其脑梗死体积; Tunel法检测缺血区脑组织细胞凋亡情况。应用免疫荧光法观察基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、水通道蛋白4(AQP4)分别与星形胶质细胞和血管内皮细胞共表达情况；各组大鼠根据再灌注时间以改良的神经功能评分评估大鼠神经功能缺损情况；免疫组织化学染色和Western blot法检测脑缺血大鼠MMP-2、AQP4.闭锁小环蛋白(ZO-1)、闭合蛋白(Occludin)、双股密封蛋白(Claudin-5)的表达；采用实时荧光定量PCR法检测脑缺血大鼠MMP-2、AQP4、ZO-1、Occludin、Claudin-5mRNA及脑组织和外周血清中miRNA-29、miRNA-320的表达； 实验结果 1.TTC染色显示：假手术组大鼠双侧脑组织呈鲜红色,未见缺血性改变；脑缺血再灌注损伤大鼠右侧脑组织大脑中动脉供血区域,可见到白色的梗死灶,与鲜红色的正常脑组织形成对比。电针组和药物组大鼠脑梗死体积低于模型组(P0.05),电针组大鼠脑梗死体积与药物组相比无统计学差异(P0.05)。 2. TUNEL检测结果显示：棕黄色染色主要表达于胞核；假手术组凋亡细胞百分比显著低于其他各组(P0.05)；电针组和药物组细胞凋亡低于模型组(P0.05)；电针组和药物组的细胞凋亡率无显著性差异(P0.05)。 3.神经功能缺损情况：mNSS评分显示,假手术组大鼠脑组织无缺血,无肢体功能障碍,评分为0分；在同期各个时间点,电针组和药物组的评分均显著低于模型组(P0.05)；在同期各个时间点,电针组和药物组神经功能情况无显著性差异(P0.05)。 4.血脑屏障相关指标：(1)免疫荧光双染显示,脑缺血再灌注损伤后,MMP-2和AQP4主要表达在星形胶质细胞足部并沿血管内皮分布；(2)MMP-2在假手术组呈低表达；模型组、电针组和药物组的峰值均在5d,与模型组相比,电针组及药物组的MMP-2的蛋白及mRNA的表达均明显降低(P0.05),在1、5d时间点,电针组MMP-2的蛋白及mRNA水平显著高于药物组(P0.05)；(3)同期各个时间点,电针组和药物组ZO-1的蛋白及mRNA水平高于模型组(P0.05),在5、7d时间点ZO-1的蛋白及mRNA的表达在电针组和药物组之间无统计学意义(P0.05)；(4)与模型组相比,电针组和药物组Claudin-5蛋白的表达显著升高(P0.05)；(5)在1、3、5d时间点,电针组和药物组Occludin的蛋白及mRNA表达高于模型组(P0.05),同期各个时间点, Occludin mRNA表达在电针组和药物组之间无统计学意义(P0.05)；(6)AQP4在模型组、电针组和药物组的表达均成单峰,峰值为3d,与模型组相比,电针组AQP4蛋白及mRNA的表达在5、7d时间点显著降低(P0.05),电针组AQP4mRNA的表达在7d时间点低于药物组(P0.05)；(7)同期各个时间点,电针组和药物组脑组织及外周血清中miRNA-29c的表达低于模型组(P0.05),电针组与药物组都能下调miRNA-29c表达,电针组miRNA-29c在同一时间点的表达高于药物组(P0.05)。(8)同期各个时间点,电针组和药物组脑组织及外周血清中miRNA-320的表达高于模型组(P0.05),电针组与药物组都能上调miRNA-320的表达,电针组miRNA-320在同一时间点的表达低于药物组(P0.05)。 结论 1.大鼠脑缺血再灌注后脑组织中导致血脑屏障损伤的因子MMP-2、AQP4及miRNA-29c的表达增加,维系血脑屏障正常物质代谢的因子ZO-1、Occludin、 Claudin-5及miRNA-320表达降低。 2.大鼠脑缺血再灌注后外周血清中miRNA-29c的表达增加,miRNA-320表达降低,与脑组织中表达趋势一致。 3.针刺干预大鼠百会、足三里穴能下调MMP-2、AQP4及miRNA-29c的表达；上调ZO-1、Occludin、Claudin-5及miRNA-320表达。 4.针刺百会、足三里穴可明显改善脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能缺损,减少脑梗死体积和细胞凋亡。 创新点 以线栓法成功复制了经典的脑缺血再灌注损伤大鼠模型,根据再灌注后时间分为1d、3d、5d和7d时间点,观察针刺百会、足三里穴对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织MMP-2、AQP4、ZO-1、Occludin、Claudin-5的表达以及脑组织及外周血清中miRNA-29、miRNA-320的表达情况,探讨了针刺对脑缺血再灌注损伤后血脑屏障破坏的保护作用机制；研究证明针刺百会、足三里穴对脑缺血再灌注大鼠血脑屏障损伤有保护作用。 经文献检索,尚未发现针刺百会和足三里穴同时对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织及外周血清中miRNA-29、miRNA-320的干预研究。
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【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R245

【参考文献】

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本文编号：2393323