Notch信号通路在机械通气肺损伤中的作用及机制研究

发布时间：2019-02-13 02:08

【摘要】：研究背景机械通气在临床麻醉中为应用肌松药的全身麻醉患者提供呼吸支持，是全身麻醉不可缺少的一部分，也是临床上治疗急性呼吸窘迫综合症（acuterespiratory distress syndrome，ARDS）和其他原因所致呼吸衰竭的主要手段之一，但其本身就具有致肺损伤作用，称之为机械通气性肺损伤（ventilator-induced lung injury，VILI），减轻VILI的通气策略能够降低ARDS患者的死亡率。对需行机械通气支持治疗的ARDS或其他高危患者，预防和减轻机械通气性肺损伤成为麻醉围手术期医学和危重病医学研究的热点和难点。以往认为VILI的发生机制为肺气压伤（暴露于过高的跨肺压）、肺容积伤（肺泡过度膨胀）、肺不张伤（肺泡反复开放关闭）等机械伤，现在研究的焦点则为“生物伤”，即机械性物理作用可以作用到效应细胞内各种信号传导途径，参与基因的调控，诱导细胞凋亡、损伤、迁移或各种表型的改变，触发一系列炎症反应、炎症介质级联散播效应，引起局部甚至系统性的炎症反应，在肺损伤中发挥重要作用。在肺部炎症反应的发生发展过程中，机体固有免疫系统发挥重要作用，其中巨噬细胞是固有免疫的重要环节。肺泡巨噬细胞是肺部常驻细胞，是肺部第一道固有免疫屏障，当肺部受病原体侵袭或伤害性刺激时，肺泡巨噬细胞早期活化，并启动免疫炎症反应，在VILI产生机制中发挥重要的调节作用，但机械通气中肺泡巨噬细胞活化的启动、激活、调控机制尚未完全阐明。 Notch信号通路在巨噬细胞的免疫应答中发挥调节作用，其可能参与巨噬细胞活化并调节成熟巨噬细胞的功能。Notch信号通路和TLR (Toll-likereceptor，TLR)4通路可能存在交互作用，后者已经被证明在机械通气肺损伤发挥重要作用。因此，Notch信号通路在机械通气肺损伤中可能也发挥调节作用。全身麻醉药的器官保护作用是麻醉学领域研究的方向和热点，其中常用吸入麻醉药异氟烷对各种原因引起的肺损伤有保护作用。异氟烷可以减轻各种因素导致的肺部炎症，从而减轻肺损伤。体外研究也证明异氟烷可以减轻巨噬细胞的炎症反应，这可能是其减轻机械通气肺损伤的机制之一。异氟烷可以调节Notch信号通路表达，从而发挥其在脑缺血性损伤中的保护作用。Notch信号通路可以通过NF-κB途径调节巨噬细胞的功能，这在机械通气肺损伤中可能发挥调节作用。异氟烷也可以通过抑制NF-κB活性减少单核细胞受LPS刺激所产生的炎性因子，对NF-κB途径的抑制也参与其器官保护作用机制。因此，Notch信号通路可能是异氟烷肺保护效应时的作用靶点。异氟烷可能通过对巨噬细胞Notch信号通路的调控，抑制炎症反应，发挥其在机械通气肺损伤中的保护作用。研究阐明Notch信号通路在机械通气肺损伤中的作用及机制，有利于为临床上干预机械通气肺损伤提供新的线索和靶点；研究异氟烷对机械通气肺损伤及Notch信号的影响，可以为异氟烷在机械通气患者的应用提供新的理论支持。第一部分机械通气对肺泡巨噬细胞Notch信号通路激活的影响目的：建立小鼠机械通气肺损伤模型，研究机械通气对肺泡巨噬细胞Notch信号通路激活的影响。方法： C57BL/6小鼠随机分为3组（n=6）：对照组（Con）、低潮气量组（LVT，，VT=7ml/kg）和高潮气量组（HVT，VT=20ml/kg）。机械通气均持续4小时，于机械通气后取肺组织，通过肺组织病理学检查、肺组织湿干重量比、肺EBA渗透指数、肺泡灌洗液中蛋白含量评估肺损伤情况，肺泡灌洗液中细胞总数和炎性因子测定评估肺部炎症反应，并于机械通气后分离收集肺巨噬细胞PCR检测Hes-1、Hes-5mRNA水平，Western Blot方法检测NICD、Hes-1、Hes-5蛋白含量，免疫荧光进一步评价相关蛋白在巨噬细胞中的表达情况。结果：和对照组相比，高潮气量机械通气可以诱发肺损伤，增加肺组织湿干重比、EBA渗透指数及肺泡灌洗液蛋白含量，增加细胞灌洗液中细胞总数及TNF-α、IL-6、MIP-2等炎性因子的表达。机械通气后分离收集肺巨噬细胞，RT-PCR显示高潮气量机械通气后Hes-1基因水平未有明显变化，而Hes-5水平明显上调；Western Blot显示高潮气量通气4小时后肺巨噬细胞中NICD、Hes-5的蛋白水平明显上调，Hes-1蛋白水平未有明显变化，细胞免疫荧光显示巨噬细胞中Hes-5的蛋白水平明显上调。结论：高潮气量机械通气可以上调肺泡巨噬细胞中Notch信号通路相关蛋白分子，激活巨噬细胞Notch信号通路。第二部分Notch信号通路在机械通气肺损伤中的作用及机制目的：1、研究机械通气肺损伤中肺泡巨噬细胞Notch信号上调的是否受TLR4调控；2、研究Notch信号通路在机械通气肺损伤中的作用及机制。方法：1、野生型小鼠和TLR4基因敲除小鼠（n=6）在机械通气肺损伤后分别评估肺泡巨噬细胞中NICD的表达情况，探究Notch信号通路的上调是否受TLR4途径调控。2、在机械通气前经腹腔给予Notch信号通路抑制剂DAPT100mg/kg。对照组和高潮气量通气组给予等剂量DAPT的溶剂DMSO作为对照。机械通气结束后，评估肺损伤情况，测定肺泡灌洗液炎性因子评估肺部炎症反应，分离收集肺巨噬细胞，Western Blot方法检测NICD、Hes-5、p-IκBα和IκBα蛋白含量。结果：1、在高潮气量机械通气4小时后，野生型小鼠肺泡巨噬细胞NICD蛋白表达水平上调，而TLR4基因敲除小鼠巨噬细胞中NICD蛋白无明显上调。2、DAPT组NICD和Hes-5水平明显下降，肺损伤程度明显轻于单纯高潮气量通气组，肺组织湿干重量比、肺EBA渗透指数、肺泡灌洗液中蛋白含量平均低于高潮气量通气组；DAPT降低肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、MIP-2等炎性因子水平。高潮气量机械通气后肺巨噬细胞磷酸化IκBα（p-IκBα）蛋白表达水平表达上调，IκBα蛋白降解增多，DAPT可以抑制高潮气量机械通气后肺泡巨噬细胞中p-IκBα的上调和IκBα蛋白的降解。结论：机械通气肺损伤中Notch信号通路的表达变化受TLR4调控；Notch信号通路参与机械通气肺损伤的调节，其机制可能和激活NF-κB途径有关。第三部分异氟烷对机械通气肺损伤中Notch信号通路的影响目的：研究异氟烷预处理和通气中吸入在机械通气肺损伤的肺保护作用以及对Notch信号通路的影响。方法：1、C57BL/6小鼠随机分为3组（n=6）:对照组（Con）、高潮气量组（HVT）、异氟烷预处理组(Iso-pre)。Iso-pre组小鼠接受1.4%异氟烷的预处理后，再行VILI造模，并评估肺损伤程度及肺部炎症，以及对Notch信号通路表达的影响。2、C57BL/6小鼠随机分为3组（n=6）:对照组（Con）、高潮气量组（HVT）、异氟烷处理组（Iso-vent）。Iso-vent组在通气中吸入1.4%异氟烷，机械通气后评估肺损伤程度及肺部炎症，以及对Notch信号通路表达的影响。结果：异氟烷预处理和通气中吸入都可以一定程度上改善肺部病理学表现，肺组织湿干重量比、肺EBA渗透指数、肺泡灌洗液中蛋白含量均低于高潮气量通气组，异氟烷处理减低肺泡灌洗液中细胞总数以及TNF-α、IL-6、MIP-2等炎性因子的表达水平，并能抑制机械通气后NICD、Hes-5的表达水平。结论：预处理和通气中吸入异氟烷都可能通过抑制Notch信号通路减轻机械通气肺损伤。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R614

【参考文献】