小肠旁路手术对非肥胖糖尿病大鼠糖脂代谢的改善作用及机制研究

发布时间：2019-04-25 16:06

【摘要】：第—部分小肠旁路手术模型的建立及效果评价背景糖尿病(Diabetes Mellitus)是当今社会中严重威胁人类健康的疾病,它不仅带来高致残率与高病死率,而且造成巨大的经济消耗和社会负担。根据流行病学资料,2013年,全球的糖尿病患者共约3.82亿人,预计这一数字将于20年后超过5.9亿。我国已有超过1亿人受到糖尿病困扰,位居世界第一,且这一人数仍在不断增加。控制糖尿病及其并发症刻不容缓。然而,传统手段如控制饮食、运动、口服降糖药物、胰岛素治疗等,并不能达到长期、满意的血糖控制,也无法有效降低糖尿病并发症的发生率和死亡率。经过研究人员对实验动物的研究和对临床病人的随访,“代谢手术”这一概念被越来越多的学者所接受,被认为是目前治疗顽固性糖尿病的有效手段,已写入糖尿病治疗的临床指南之中。目前最流行的代谢手术方式为Roux-en-Y式胃旁路术(Roux-en-Y gastric bypass, RYGB)。RYGB疗效确切,但其对技术操作要求高,并发症发生率相对较高；其他手术方式也存在类似的问题。能否设计一种技术上更加简单、安全的手术方式,依然是外科医生的探索和追求。另外,RYGB等胃肠道代谢手术改善糖代谢的机制目前尚不明确,仍需要进一步研究。根据著名的“后肠假说”理论,食糜与末段回肠的快速接触利于血糖的控制。基于此,我们设计了一种新型的、简单易行的小肠旁路手术模型,研究术后代谢指标的变化,判断其安全性和有效性,并进一步借助其进行机制研究。这种手术方式此前未见于文献报道。为了避免在名称上与既往的“空回肠旁路术”(jejuno-ileal bypass)相混淆,我们根据其消化道重构后的解剖特点,将此新型的小肠旁路手术方式命名为“空肠-回肠环路术”(jejuno-ileal circuit, JIC)。目的以糖尿病大鼠为研究对象,建立一种新型的小肠旁路手术模型(即JIC),综合以下问题进行研究：(1)JIC的安全性和有效性；(2)与经典手术方式——回肠转位术(ileal interposition, I T)进行对比,进一步验证其对糖尿病的改善作用；(3)研究不同距离的食糜传输对于血糖改善作用的影响。方法以高脂饮食(high-fat diet diet, HFD)喂养联合小剂量(30mg/kg)链脲佐霉素(streptozotocin, STZ)注射,诱导12周龄的雄性Wistar大鼠产生胰岛素抵抗及非肥胖型糖尿病。糖尿病大鼠随机分为以下五组：(1)短空肠段的JIC组(JIC-short jejunum, JIC-S):距离屈氏韧带(Treitz) 5 cm处的空肠与远端回肠进行吻合；(2)长空肠段的JIC组(JIC-long jejunum, JIC-L)：距离Treitz韧带20 cm处的空肠与远端回肠进行吻合；(3)JIC假手术组(Sham-JIC):开腹后像JIC手术一样进行肠道的暴露和探查,而并不改变肠道的解剖：(4)IT组：行IT手术,将10 cm长的末端回肠转位至距离Treitz韧带10 cm处；(5)IT假手术组(Sham-IT):同IT般切断相应肠道,然后实施原位吻合。假手术组的手术时间延长至与手术组一致,以保证相同程度的麻醉影响和体液丢失。手术后观察实验动物的并发症发生情况及存活率,并检测如下指标：(1)体重、进食量、饮水量；(2)随机血糖(非空腹)：每周3次；(3)葡萄糖耐量：在术前及术后第2、4、8、12周进行口服葡萄糖糖耐量试验(oral glucose tolerance test,OGTT);(4)胰岛素耐量：术前及术后第4、12周进行胰岛素耐量试验(insulin tolerance test, ITT); (5)血清学指标：术后第4、12周采空腹血,检测肝肾功能指标及胰岛素水平；(6)评估胰岛素抵抗：术后第4、12周以“稳态模型”评价胰岛素抵抗(homeostasis model assessment of insulin resistance, HOMA-IR).结果1.与IT手术相比,JIC手术时间更短；JIC手术后无出血、吻合口漏、梗阻、营养不良等并发症发生。2.JIC手术并未改变实验动物的体重和进食量。术后JIC-S组和IT组饮水量下降,这与血糖改善的趋势一致。3.与假手术相比,JIC-S和IT术后12周肝肾功均有改善。4.相比于假手术组,JIC-S、IT术后空腹胰岛素分泌量增加。5.JIC-S术后血糖代谢明显改善,具体表现为随机血糖降低、糖耐量及胰岛素耐量改善、胰岛素抵抗减轻。其效果与IT效果相当。6.JIC-L并不能达到JIC-S对糖尿病的改善效果。结论1.作为新型的小肠旁路手术模型,JIC-S操作简单,安全性高。2.JIC-S对糖尿病大鼠的肝肾功、血糖稳态,胰岛素分泌及敏感性均有改善作用,效果与IT相似。这种改善作用并不伴随体重变化。3.相比JIC-S, JIC-L术式延长了食糜的传输距离,延缓了营养物质与远端小肠的接触,其对于胰岛素抵抗和糖代谢并无明显改善作用。这与“后肠假说”理论一致。4.JIC-S是理想的试验性手术方式。其改善糖尿病的机制将在下一部分进行探讨。第二部分空肠-回肠环路术改善葡萄糖代谢的机制研究背景胃肠道代谢手术(有时也被笼统称为“减重手术”)能够快速、持久地改善胰岛素抵抗、缓解糖尿病,但机制尚不明确。体重下降并非主要原因,因为血糖的改善往往早于体重的减轻,而且某些手术方式并未明显影响体重却仍可达到降糖效果。目前一般认为,代谢手术后糖代谢的改善包括体重依赖性和非体重依赖性两方面机制,在术后早期以后者为主。探寻不依赖于体重的具体机制一直是研究者们努力的方向。研究表明,小肠在代谢改善的过程中发挥重要作用,相关机制的推测主要有“前肠假说(近端小肠假说)”和“后肠假说(远端小肠假说)”,但目前尚未形成统一理论。为了更好地研究小肠在术后血糖改善中发挥的不依赖减重的作用,本实验以非肥胖型糖尿病大鼠为研究对象,设计了JIC手术方式,并联合IT进行研究。从解剖特点上看,JIC和IT都只改变了小肠的解剖,而保持了胃和幽门的完整性,适合研究小肠尤其是远端小肠的作用。课题的第一部分已经证实了JIC-S的安全性和有效性,而在本部分,我们将主要从食糜传输、肠道激素等方面探讨术后血糖改善的机制。此外,肝脏对葡萄糖的利用以及糖异生过程也对血糖的平衡产生影响,此方面的相关指标本研究也有涉及。目的以肠道相关因素的变化为切入点,探讨空肠-回肠环路术后血糖改善的相关机制。方法以第一部分的实验动物作为研究对象,检测下述指标并进行组间对比：(1)术后第4、12周采血,检测胰岛素浓度；(2)检测术后第4、12周血清中胰高血糖素样肽-1(glucagonlike peptide 1, GLP-1)、多肽YY (peptide YY,PYY)、葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(glucose-dependent insulinotropic peptide, GIP)等肠道激素水平；(3)术后12周取肝脏标本,以聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)测定葡萄糖转运体2的信使RNA水平(glucose transporter 2 messenger RNA, GLUT2 mRNA);(4)以蛋白质免疫印迹(Western blotting, WB)方法检测肝脏糖异生关键酶：葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase, G6P)及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase, PCK)水平；(5)大鼠处死前灌注染料,借此测量肠道内食糜的传输速度。结果1.术后4周及12周,JIC-S组和IT组胰岛素水平明显高于其他各组,且二者水平相近。2.相比于其他组,术后JIC-S组和IT组的GLP-1、YY浓度均升高；JIC-S和IT组之间无差别。GIP水平各组之间保持一致。3.术后12周,JIC-S组和IT组在肝脏GLUT2 mRNA的表达上高于其他三组。4.WB显示,术后12周肝脏的G6P和PCK水平在JIC-S和IT组显著下降。5.术后12周染料在大鼠肠道内的推进情况显示,在JIC-S组和IT组,食糜均快速接触了远端回肠。结论1.JIC-S和IT术后胰岛素水平升高,利于高血糖的控制。2.GLP-1和PYY的升高,是JIC-S和IT术后葡萄糖糖稳态好转的重要原因。3.JIC-S和IT术后肝脏葡萄糖转运体的表达上调,提示肝脏摄取葡萄糖能力增强；而肝脏糖异生关键酶的表达下调,提示糖异生过程受抑制,肝糖输出减少。这些变化均有益于糖尿病的好转。4.上述因素的变化,推测是由于JIC-S以及IT手术后食糜快速接触了远端回肠所致。这与“后肠假说”内容一致。第三部分空肠-回肠环路术对脂代谢异常的改善作用背景脂质代谢异常,也称为脂质代谢紊乱(lipid dysmetabolism),是血液及其他组织器官中脂质及其代谢产物质和量的异常,包括血脂异常、非酒精性脂肪肝等。脂质代谢异常显著增加心血管疾病、肝脏疾病等风险,威胁人类健康。脂质代谢紊乱并非一种独立疾病,而是与胰岛素抵抗和葡萄糖代谢异常互为因果,并共同参与代谢综合征的发生发展。有文献证明,糖尿病患者更容易发生脂质代谢异常,反之亦然。对于脂质代谢紊乱,尤其是非酒精性脂肪肝,过去缺乏行之有效的治疗手段。胃肠道代谢手术的兴起为之提供了新的希望,目前已有许多文献证实,RYGB、IT、袖状胃切除术(sleeve gastrectomy,SG)、十二指肠空肠旁路术(duodenal-jejunal bypass, DJB)以及胆胰转流术(biliopancreatic diversion, BPD)均有改善脂质代谢的作用。胃肠道代谢手术已成为治疗脂质代谢异常的重要手段,然而对于术后高血脂或脂肪肝恢复的原因和机制,目前尚缺乏定论。在前面的实验中,我们证实了JIC-S对糖尿病大鼠血糖的改善作用,然而,这种新型手术方式是否同样可以改善脂质代谢,尚需进一步研究。根据本研究的前两部分,JIC-S能够有效改善糖尿病大鼠的肝功水平及胰岛素敏感性。鉴于胰岛素敏感性的恢复有利于脂质代谢的改善,而肝功的好转可能意味着脂肪肝的改善,我们推测,JIC-S对脂质代谢异常有治疗作用。为了证实这一推测,在这一部分,我们从血脂、脂肪因子、肝脏脂肪聚集情况等方面进行检测,研究JIC-S术后脂质代谢的变化及机制。考虑到脂质代谢与糖代谢的相互影响,术后脂质代谢的改善也可能是手术后糖尿病好转的原因之一。根据前两部分实验,JIC-S对糖尿病有治疗作用而JIC-L没有,因此本部分并不涉及JIC-L手术,仅以JIC-S作为空肠-回肠环路手术的代表。目的以非肥胖型糖尿病大鼠为研究对象,研究JIC手术(即前两部分所述的JIC-S)改善脂质代谢的作用及相关机制。方法以文献报道为依据,以HFD长期喂养联合小剂量STZ注射,诱导13周龄的雄性Wistar大鼠产生胰岛素抵抗及非肥胖型糖尿病,同时伴有肝脏脂肪堆积的发生。糖尿病大鼠随机分为JIC组及Sham-JIC组。JIC的手术方式与本实验第部分中关于JIC-S的描述一致；Sham组则实施相同位置的肠切开术,但并不像JIC一样进行远近端的吻合,而是原位缝合。手术后记录实验动物的并发症情况及存活率,并检测如下指标：(1)体重、进食量；(2)OGTT-在术前及术后第4、12周进行；(3)ITT：术前及术后第4、12周进行；(4)丙酮酸耐量试验(Pyruvate Tolerance Test, PTT):术前及术后第4、12周进行；(5)血清学指标：术后第4、12周采血,检测甘油三酯、胆固醇、游离脂肪酸和总胆汁酸水平；(6)激素水平：术后第4、12周采血,分别检测GLP-1、瘦素及脂联素水平；(7)术后12周处死大鼠,取肝脏标本,以WB方法检测肝脏脂肪生成的关键酶：脂肪酸合酶(fatty acid synthase, FAS)及乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase, ACC);(8)取肝脏标本,分别进行HE染色和油红O染色,判断其脂肪聚集情况；(9)术后12周取大鼠回肠标本,对肠内分泌细胞及其分泌的GLP-1进行免疫组化染色; (10)术后12周取大鼠粪便标本,检测肠道菌群中拟杆菌和厚壁菌门的含量。结果1.整个实验期间两组的体重和进食量均无明显差别。2.相比于假手术,JIC术后OGTT, ITT和PTT均有显著改善。3.手术后JIC组的大鼠较sham组大鼠有更低的血清甘油三酯和游离脂肪酸水平,而胆固醇水平并无明显差别。4.手术后12周,JIC组的血清总胆汁酸水平升高。5.JIC术后血清中的和肠道分泌的GLP-1水平均升高。6.JIC术后12周,血清瘦素水平下降,而脂联素浓度升高。7.术后12周WB结果提示JIC组肝脏FAS及ACC表达均下降。8.HE染色及油红O染色均提示JIC术后肝脏脂肪变的程度缓解。9.术后12周,与sham组相比,JIC组肠道菌群中拟杆菌所占比例升高,而厚壁菌门比例无明显差别。结论1.JIC发挥了不依赖体重的调节脂质代谢的作用,对血脂升高和肝脏脂肪变性均有改善效果。2.JIC改善了胰岛素抵抗,这与脂质代谢的好转密切相关。3.GLP-1的升高、脂肪因子的变化、血清胆汁酸水平的升高以及肠道菌群的改变,可能是胰岛素敏感性恢复和脂质代谢好转的原因。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R656.7;R587.1
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本文编号：2465273