S-腺苷蛋氨酸对肝内胆汁淤积大鼠肝脏的保护及其与FXR相关机制的研究

发布时间：2019-05-22 02:26

【摘要】：研究背景胆汁淤积是胆汁成分及代谢产物在肝内或体内异常积聚引起的临床综合症,是多种疾病的共同特点。毒性胆汁酸在体内的积累,可导致肝细胞的炎症反应和肝组织纤维化,最终可发展为肝硬化、肝癌或胆管细胞癌等。根据发生的部位不同,可分为肝内胆汁淤积(intrahepatic cholestasis, IHC)和肝外胆汁淤积；肝外胆汁淤积多由梗阻性因素引起,临床上常见的病因如胆结石、胆管癌或壶腹部肿瘤等；IHC的病因较多且更为复杂。胆汁淤积的主要机制为胆汁合成和转运障碍,这个过程受到一系列膜受体、核受体及其转录因子转录的调控；其中,法尼酯受体(farnesoid X receptor, FXR)是一种胆汁酸受体和胆汁酸合成的生物感受器,主要表达在肝、肠、肾脏、肾上腺等脏器,在心、肺、脂肪、胃也有少量表达。在肝肠组织中,FXR及其靶基因的激活可调节多种转运蛋白和合成酶的表达,促进细胞内胆汁酸排出和解毒,抑制胆汁酸的重吸收和合成来调节自身平衡,对维持体内胆固醇、胆汁酸代谢平衡起重要作用。 FXR调节胆汁酸代谢的靶基因指导合成的胆盐输出泵(bile salt export pump,Bsep)介导肝细胞内一价胆汁酸向胆管内转运；多重耐药相关蛋白2(multidrug resistance-associated protein2, Mrp2)位于胆管膜侧,介导非胆盐性有机阴离子如胆红素、二价胆汁酸、葡萄糖醛酸胆红素、谷胱甘肽向胆管内排泄；钠-牛磺胆酸转运多肽(Na+-taurocholate cotransporting polypeptide, Ntcp)位于肝细胞窦膜侧,是表达于肝细胞基底膜的主要的胆汁酸摄取系统,从门静脉摄取胆汁酸的主要转运子。FXR激活后,可调控肝脏中Bsep、Mrp2、Ntcp的表达,使肝细胞及胆小管调节胆汁酸盐和其他有机阴离子的摄取和排泄。因此,FXR的激活可能对高胆红素血症、胆汁淤积等疾病起治疗作用。 S-腺苷蛋氨酸(S-Adenosyl-L-methionene, SAMe)是人体内重要的生物分子,参与体内的多种生化反应,在转甲基、转巯基、转氨丙基过程中起着重要作用。SAMe可增加细胞膜磷脂的流动性和Na+-K+-ATP酶的活性,加快胆汁酸运转,加速代谢产物的排泄,影响细胞膜信号通路的传输；可以辅助合成肝细胞内的半胱氨酸、谷胱甘肽、牛磺酸等,对抗氧自由基及炎性物质对细胞的损伤；影响细胞内基因表达及对多聚胺的需求,调节细胞生长、分化及功能等。早期的多项研究表明,SAMe能改善多种胆汁淤积性肝病患者的胆汁酸、胆红素及转氨酶水平,减轻肝组织炎症反应,减轻肝纤维化,并且有可长期使用、副作用少等优点,在临床上广泛应用。因为SAMe作用通道较多,它对肝病患者肝脏起保护作用的分子机制主要表现在提高线粒体内谷胱甘肽的水平,维持线粒体膜的动态和稳定性,抑制肝星状细胞合成胶原蛋白等方面；但SAMe与FXR及其靶基因转录合成的转运体Bsep、Ntcp、Mrp2的关系,不能完全排除。目的探讨SAMe对肝内胆汁淤积大鼠的肝脏保护作用及其与肝组织FXRmRNA、转运体Bsep、Ntcp、Mrp2表达的关系,从而进一步了解SAMe的作用机制,并为研制对肝内胆汁淤积疾病有效的药物提供依据。方法用50mg/kg1%α-奈异硫氰酸酯(α-Naphthyl isothiocyanate, ANIT)建立肝内胆汁淤积模型,以FXR.激动剂GW4064为对照,按建模后腹腔注射药物不同分为六组,即A：橄榄油+SAMe溶剂；B：IHC+生理盐水(nornal saline, NS); C:IHC+SAMe; D:IHC+GW4064; E:IHC+二甲亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO);F:IHC+SAMe溶剂。给药后48h麻醉后取血及肝组织,检测各组大鼠血清中总胆固醇(cholesterol,chol)、总胆汁酸(total bile acids,TBA)、总胆红素(total bilirubin,TBil)、直接胆红素(direct bilirubin,DBil)、间接胆红素(indirect biliorubin,IBil)、谷丙转氨酶(alanine transaminase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase,AST).碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、谷氨酰基转移酶(γ-glutamyl transpeptidase,GGT)水平,PCR法检测肝脏中FXR mRNA的表达,原位杂交法检测Bsep.Ntcp.Mrp2的表达。所有数据使用SPSS13.0软件,方差分析或卡方检验方法分析各组数据,P值小于0.05表示有统计学意义。结果血清学指标(1)IHC+NS组与IHC+SAMe溶剂组/IHC+DMSO组相比,各两组大鼠血清中chol(4.95±1.78vs.9.20±1.97/8.50±1.70).TBA(332.67±244.79vs.481.23±47.50/471.47±32.41).TBil(139.97±52.73vs.234.53±31.04/232.07±25.52).DBil(71.57±25.25vs.145.70±33.80/92.17±16.29).IBil(68.40±27.80vs.88.83±8.54/139.90±35.79).ALT(966.67±675.52vs.1214.33±247.55/1310.6±257.26).AST(2269.67±1460.16vs.2810.00±329.24/2600.33±146.77). ALP(1094.33±286.55vs.1207.33±253.07/1352.00±46.52).GGT(6.00±1.57vs.9.67+4.73/4.67±1.16)无统计学差异,P0.05,表明SAMe溶剂、DMSO对上述血清学指标无明显影响,可排除SAMe溶剂、DMSO对上述血清学生化指标的干扰。(2)IHC+SAMe组与IHC+NS组/IHC+GW4064组相比,大鼠血清中chol (2.01±0.19vs.4.95±1.78/4.29±0.65).TBA(41.80±4.32vs.332.67±244.79/281.33±118.20).TBil(5.47±3.86vs.139.97±52.73/124.16±22.30).DBil(0.43±0.21vs.71.57±25.25/67.33±8.02).IBiL(5.03±4.06vs.68.40±27.80/56.83±14.45).ALT(31.00±9.64vs.2269.67±1460.16/808.33±635.56).AST(118.67±17.21vs.2600.33±146.77/987.00±643.47).ALP(755.33±97.78vs.1352.00±46.52/1038.67±160.18).GGT(3.00±1.65vs.6.00±1.57/6.33±1.16)有统计学差异,P0.05,表明SAMe对ANIT诱导的胆汁淤积大鼠具有肝脏保护作用,且比实验中所用剂量GW4064对肝脏的保护作用更明显。(3) IHC+SAMe组与橄榄油+SAMe溶剂组相比,chol (3.46±0.69vs.2.01±0.19)、TBA (41.80±4.32vs.48.27±38.23)、TBil (5.47±3.86vs.2.80±0.10)、DBil (0.43±0.21vs.0.60±0.10)、 IBil (5.03±4.06vs.2.20±0.10)、ALT (31.00±9.64vs.47.67±8.51)、AST (118.67±17.21vs.149.00±16.00)、ALP (755.33±97.78vs.694.00±28.60). GGT (3.00±1.65vs.1.00±0.60)无统计学差异,P0.05,表明SAMe处理后的胆汁淤积大鼠与无胆汁淤积大鼠中各血清学指标接近,SAMe对胆汁淤积大鼠肝脏的肝功能有很好的恢复作用。肝脏组织学橄榄油+SAMe溶剂组肝组织结构基本正常,肝小叶存在,肝索成放射状排列整齐；IHC+NS组肝小叶结构紊乱,可见片状肝细胞坏死,IHC+DMSO组、IHC+SAMe溶剂组表现与IHC+NS组类似,提示造模后大鼠肝细胞坏死,肝组织受损,且SAMe溶剂、DMSO对肝组织影响不大；IHC+SAMe组肝小叶结构存在,肝细胞索排列整齐,肝细胞内仅见空泡样改变,提示所用剂量SAMe对肝组织有明显保护作用；IHC+GW4064组部分肝小叶结构紊乱,可见坏死肝细胞团,但病灶较IHC+NS组、IHC+DMSO组、IHC+SAMe溶剂组小,提示所用剂量GW4064对肝组织有一定保护作用。肝组织FXR mRNA表达(1)IHC+NS组与IHC+SAMe溶剂组/IHC+DMSO组相比,各两组FXR mRNA表达量均无统计学差异(0.18±0.07vs.0.18±0.05/0.20±0.02,P0.05),表明SAMe溶齐、DMSO对肝组织中FXR mRNA的表达量无明显影响。(2) IHC+SAMe组/IHC+GW4064组与IHC+NS组相比,有统计学差异(0.35±0.03/0.28±0.06vs.0.18±0.07,P0.05),说明所用剂量SAMe、GW4064均可提高肝组织中FXR mRNA的表达。(3) IHC+SAMe组与IHC+GW4064组无统计学差异(0.35±0.03vs.0.28±0.06,P0.05),两者对表达的影响差异不大。(4) IHC+SAMe组与橄榄油+SAMe溶剂组相比,有统计学差异(0.35±0.03vs.0.23±0.04, P0.05), IHC+SAMe组比橄榄油+SAMe溶剂组表达量增加,提示SAMe对肝脏保护作用可能与FXR mRNA表达增加有关。 Bsep、Mrp2、Ntcp的表达IHC+NS组与IHC+SAMe溶剂组、IHC+DMSO组比较,Bsep/Mrp2/Ntcp表达的阳性率无明显差异(阳性率均为16.7%),排除SAMe溶剂、DMSO对Bsep/Mrp2/Ntcp表达的影响。与橄榄油+SAMe溶剂组/IHC+NS组/IHC+SAMe溶剂组/IHC+DMSO组比较,IHC+SAMe组、IHC+GW4064组Bsep/Mrp2/Ntcp表达的阳性率增强(16.7%vs.100%,χ2=5.486,P=0.019,0.05),主要表达在细胞质中,提示SAMe对胆汁淤积大鼠的保护作用,与Bsep、Mrp2、Ntcp的表达增强有一定关系。结论 SAMe可降低ANIT诱导的IHC大鼠血清中chol、TBA、TBil、DBil、IBil、 ALT、AST、ALP、GGT水平,减少肝细胞损伤,对肝脏起保护作用,其肝功能的恢复水平可达到基本正常；补充外源性的SAMe可恢复IHC大鼠的肝脏损伤。SAMe可增强IHC大鼠肝组织中FXR mRNA的表达,增强肝细胞胞质中Bsep、 Mrp2、Ntcp的表达,促进胆汁排泄和代谢,与SAMe的肝脏保护作用有关。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R575

【参考文献】