【摘要】：目的本实验以“补元”思想理论为指导,从“治未病”理念出发,分别从细胞因子含量变化、关节形态学改变、软骨细胞增殖与凋亡四个方面、不同角度与层次研究补元要药人参的有效成分人参皂苷Rg1对兔膝关节骨性关节炎的防治作用,为中医药防治骨性关节炎提供科学的实验研究依据。方法50只健康普通级新西兰雄性大白兔,分成正常组、模型组、人参皂苷Rg1低、中、高剂量组,每组10只。除正常组外,其余4组兔采用左后肢管型石膏伸直位固定法制备兔膝骨性关节炎模型。从造模第2天开始进行药物干预。人参皂苷Rg1低、中、高剂量组分别给予人参皂苷Rg15mg/kg、10mg/kg、20mg/kg灌胃给药,正常组及模型组予以等剂量生理盐水(5mL/kg)灌胃,每周3次,共6周。1.炎性细胞因子检测:各组分别于造模前及干预结束后,在严格无菌操作条件下行左膝关节穿刺,注入生理盐水1ml、反复抽吸多次使冲洗液混匀后抽取关节液,测定干预前后关节液中重要致炎因子白细胞介素1(IL-1)、一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量变化。2.细胞形态学观察:干预结束后在麻醉下用空气栓塞法处死所有实验兔,分别从大体肉眼观、光镜及透射电镜(TEM)等方面,观察各组兔膝关节组织形态学改变及超微结构变化,并对观察结果进行Mankin评分。3.软骨细胞增殖实验:取负重面关节软骨,采用RT-PCR技术检测软骨细胞增殖周期关键调控因子Cyclin D1、P21 mRNA表达情况;Western-blot技术检测Cyclin D1、P21蛋白表达情况;增殖细胞核抗原(PCNA)检测及细胞增殖指数(PI)分析软骨细胞增殖活性,以研究人参皂苷Rg1对软骨细胞增殖的影响。4.软骨细胞凋亡实验:取负重面关节软骨,采用RT-PCR技术检测细胞凋亡关键调控因子caspase-3、bax/bcl-2mrna表达情况;western-blot技术检测caspase-3、bax/bcl-2蛋白表达情况,原位末端标记法(tunel)观察软骨细胞凋亡率,以研究人参皂苷rg1对软骨细胞凋亡的影响。结果1.炎性细胞因子含量变化:干预前各组关节液内no、il-1、tnf-α含量无明显差异(p0.05),干预结束后模型组关节液内no、il-1、tnf-α含量较干预前显著提高(p0.01);人参皂苷rg1低、中、高剂量组no、il-1、tnf-α含量明显低于模型组,差异有明显统计学意义(p0.01),且人参皂苷rg1中、高剂量组no、il-1、tnf-α含量低于人参皂苷rg1低剂量组(p0.05或p0.01)。人参皂苷rg1中、高剂量组相比,no、il-1、tnf-α含量差别无明显统计学意义(p0.05)。2.组织形态学变化:大体肉眼观:正常组关节软骨表面整齐光滑有弹性,无软化及缺损;模型组关节软骨呈灰黄色,磨损严重,弹性差,局部出现溃疡,滑膜大量增生;人参皂苷rg1低剂量组关节软骨呈黄色,关节表面略显粗糙,无软骨缺损,滑膜少量增生;人参皂苷rg1中、高剂量组关节软骨表面尚光滑,无软骨缺损。光镜观察:正常组关节软骨表面光滑,四层结构清晰有序,潮线完整;模型组关节软骨层变薄,软骨细胞数量减少,形态发生改变,排列混乱,裂隙深达辐射层,潮线破坏,番红o染色重度减弱;人参皂苷rg1低剂量组关节软骨层次基本完整,局部有表浅裂隙,潮线尚完整,番红o染色轻、中度减弱;人参皂苷rg1中、高剂量组关节软骨层次完整,软骨表面尚光滑,排列轻度紊乱,潮线完整,番红o染色轻度减弱。mankin评分:模型组评分最高,其余各组与模型组比较,差异有显著性意义(p0.01),人参皂苷rg1中、高剂量组mankin评分低于人参皂苷rg1低剂量组,差异有统计学意义(p0.01),但中、高剂量组两组间比较差别无统计学意义(p0.05)。电镜观察:模型组软骨细胞轮廓不清,外形不规则,细胞器肿胀甚至消失,核固缩,染色质边聚,甚至出现核分裂,凋亡小体形成;人参皂苷rg1低剂量组软骨细胞轻度萎缩,轮廓尚清晰,胞浆内细胞器轻度肿胀,胞核完整,核膜稍内陷,染色质分布轻度边聚;人参皂苷Rg1中、高剂量组软骨细胞超微结构接近于正常组。3.软骨细胞增殖实验:人参皂苷Rg1低、中、高剂量组P21 mRNA及相应蛋白的表达均低于模型组(P0.05或P0.01),而CyclinD1 mRNA及相应蛋白的表达高于模型组(P0.05或P0.01),PCNA检测显示人参皂苷Rg1低、中、高剂量组软骨细胞增殖率明显高于模型组(P0.01)。各项指标中以中剂量组效果最佳。4.软骨细胞凋亡实验:模型组Bax、Caspase-3 mRNA及蛋白表达明显高于正常组(P0.01)及人参皂苷Rg1低、中、高剂量组(P0.05或P0.01);模型组Bcl-2 mRNA及蛋白表达明显低于正常组(P0.01)及人参皂苷Rg1低、中、高剂量组(P0.05或P0.01)。Tunel法检测显示,低、中、高剂量组凋亡率显著低于模型组(P0.01);中、高剂量组凋亡率无显著差别(P0.05),但低于低剂量组(P0.05或P0.01)。各项指标中以中剂量组效果最佳。结论1.伸直位管型石膏固定法造模6周,可成功建立类似临床所见的人类骨关节炎模型。2.一定剂量人参皂苷Rg1可有效减少关节液中炎性细胞因子NO、IL-1、TNF-α的含量,减轻关节炎症反应,改善关节内微环境。3.一定剂量人参皂苷Rg1可有效提高软骨细胞G1期关键正向调节蛋白CyclinDl的表达,抑制负向调控因子P21表达,推动软骨细胞顺利通过G1/S限制点,进入S期完成增殖周期,从而有效促进软骨细胞增殖和关节软骨的修复。4.一定剂量人参皂苷Rg1可通过调控软骨细胞凋亡关键因子Bax/Bcl-2表达比例、下调Caspase-3的表达来有效抑制软骨细胞过度凋亡,避免软骨组织进行性破坏。
【图文】：
图 1 关节软骨的组织学分带示意图骨无血管、淋巴组织，，也没有神经支配[13]，其营养输主要依赖关节内滑液和滑膜血管渗透，通过弥散]，关节的痛觉及本体感觉主要依赖于滑膜、关节囊的神经末稍传导。关节软骨的代谢活动受多种生化康的关节软骨处于一种合成与降解的精确动态平衡坏,将导致疾病的发生，因此健康的软骨组织是机运动的保证。生发展伴随关节软骨细胞的退变[15],虽然目前对明确[16]，但从现代医学研究看,骨关节炎的病理特发生缓慢、渐进性的退变。其病理改变始于软骨，包括滑膜、关节囊、软骨下骨，最终导致关节软骨性变和软骨下骨赘形成[17]。
软骨组织的深处扩展，直至裂缝到达软骨下骨软骨组织的厚度变薄，甚至软骨全层消蚀。当骼，刺激骨髓细胞迁移，发生炎症反应并且触软骨的骨组织。在关节表面、边缘及软骨下形来看，OA 早期关节软骨有微小裂隙,局部可见断裂,或出现双重潮线。中期裂隙延伸至中、深骨细胞簇聚，细胞致密,电子密度增加，核膜模骨下骨的裂隙,表层不完整甚至缺失,软骨下骨;细胞少,排列散乱,有大量簇聚软骨细胞,潮线,胶原纤维排列紊乱，细胞的电子密度明显增加,可见坏死或凋亡的软骨细胞：核固缩、破裂，骨质硬化、囊性变、骨赘形成,关节肥大变形心(图 2)[18]。
【学位授予单位】：湖北中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R285.5
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本文编号：2518989
