恩度抑制NSCLC患者淋巴转移的基础临床研究

发布时间：2019-08-28 21:57

【摘要】：背景肺癌是发病率和死亡率增长最快,对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近20年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高,男性肺癌发病率和死亡率均居所有恶性肿瘤的第一位,女性肺癌发病率居第二位,死亡率居第一位。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC),是最为常见的肺癌,约占肺癌总数的80-85%,包括鳞癌、腺癌、大细胞癌,与小细胞癌相比其癌细胞生长分裂较慢,扩散转移相对较晚,多通过淋巴、血液及肿瘤浸润等方式进行局部侵犯和远处转移。如何切断肿瘤浸润转移的途径是目前控制肺癌进展的重要课题。恩度(重组人血管内皮抑制素注射液,Recombinant Human Endostatin Injection)是由我国自主研发的一种抗癌新药,为内源性血管生成抑制剂,能够选择性抑制血管内皮细胞的增殖与迁移,达到抑制肿瘤形成新生血管、切断肿瘤细胞的营养供给途径、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤增殖和转移的目的。恩度对肿瘤血管生成的抑制作用已有较多研究与报道,但其对肿瘤淋巴管的生成是否存在类似的抑制作用,相关的基础实验和临床研究报道仍很少见。为此,我们设计并进行了相关基础与临床研究,以期探讨恩度对NSCLC淋巴管生成及淋巴转移的作用。目的 1.通过建立非小细胞肺癌裸鼠荷瘤模型,观察重组人血管内皮抑制素对肿瘤动物模型淋巴管生成和淋巴转移的抑制作用； 2.免疫组织化学染色法检测肺癌组织中VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3表达水平,观察恩度对VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3表达水平情况的影响； 3.采用免疫磁珠富集法负性筛选策略检测实验裸鼠外周血循环肿瘤细胞数量,对比空白对照组与各实验组循环肿瘤细胞数量的差异； 4.对比非小细胞肺癌术后单纯辅助化疗与联合恩度进行术后辅助治疗的疗效差异,根据术后定期复查结果,分析恩度联合化疗对于非小细胞肺癌患者术后一年复发率的影响； 5.根据患者术前与术后复查的影像学检查结果,对比患者全身淋巴结转移情况,评价恩度对患者术后肿瘤淋巴转移的抑制作用。方法 1.1从北京协和医科大学基础实验室细胞库购买A549人肺癌细胞株1株,胰蛋白酶-EDTA消化液消化后传代培养,传至第5代后,A549肺癌细胞数量达到建立裸鼠肺癌模型要求。 1.2BALB/C裸鼠60只,5周龄,雌雄各半,体重均为22-25g之间,购于军事医学科学院实验动物中心,裸鼠饲养在解放军304医院SPF级动物实验室。裸鼠购进后观察1周,于裸鼠右侧腋窝经皮下注射浓度为1×107/m1的A549肺癌细胞0.2m1,建立裸鼠异种移植荷瘤模型。接种肿瘤细胞3周后,选取56只建模成功的荷瘤裸鼠,肿瘤平均直径为7±0.4mm。 1.356只成瘤裸鼠随机分为8个小组(n=7),各组间裸鼠体重,肿瘤直径无显著性差异,同组雌雄裸鼠分开饲养。包括1个对照组(生理盐水0.2m1,1次/d),1个顺铂组(顺铂20μg,隔日1次),3个不同浓度恩度组(恩度1,2mg/kg；恩度2,4mg/kg；恩度3,6mg/kg；1次/d),3个恩度+顺铂组(在3个不同浓度恩度组的基础上再给予顺铂20μg,隔日1次)。所有实验用药均经尾静脉注射,连续给药2周。 1.4给药结束后观察1周,测量并记录肿瘤直径,所有裸鼠进行称重,给予水合氯醛麻醉后摘眼取血,然后处死全部裸鼠,进行完整的解剖,包括肿瘤和淋巴结解剖,以从病理学方面评估转移的存在。 1.5根据用药前后裸鼠肿瘤直径的差异评价各组药物对肿瘤生长抑制作用；组织切片采用HE染色和免疫组织化学染色诊断,免疫组织化学染色采用免疫酶标法。确定各组转移淋巴结数目,肿瘤组织微淋巴管密度,计算各组淋巴结转移阳性率。评估肿瘤组织中淋巴管生成的重要指标是组织中的微淋巴管密度,podoplanin蛋白是一种表达于脉管系统内皮细胞内的特异蛋白,对识别淋巴管内皮细胞具有较高的特异性,在NSCLC组织中,podoplanin是合适的淋巴管标记物,采用抗鼠podoplanin蛋白抗体作为一抗,PV-6000作为二抗,DAB溶液作为显色剂,使表达有podoplanin蛋白的微淋巴管内皮细胞着色,再通过高倍镜下进行微淋巴管计数,五个不同视野的平均值作为微淋巴管密度。比较各组微淋巴管密度、转移淋巴结数目及淋巴结转移阳性率的差异,评价恩度对肿瘤淋巴管生成和淋巴转移的抑制作用。 1.6通过免疫酶标法检测肿瘤组织中VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3蛋白表达水平；采用免疫磁珠富集法负性筛选策略和免疫荧光染色检测实验裸鼠外周血循环肿瘤细胞。 2.1选择2010年1月-2012年8月期间我院胸外科收治的121例Ⅱb-Ⅲa期NSCLC术后患者分为两组,对照组58例和观察组63例； 2.2对照组给予单纯化疗,包括TP/C方案(多西他赛+顺铂/卡铂)、NP方案(长春瑞滨+顺铂)、GP/C方案(吉西他滨+顺铂/卡铂),观察组在此基础上增加恩度治疗；每个治疗周期均评价药物不良反应情况； 2.3每例患者的治疗进行2-4个周期,并于术后3个月、6个月、9个月和12个月分别评价患者生存情况及肺癌转移情况。结果 1.各实验组肿瘤平均直径差值明显小于空白对照组,恩度联合顺铂各组肿瘤直径差值小于单独使用恩度各组与顺铂组；单独使用恩度与顺铂的各组之间肿瘤直径差值无明显差异。恩度各组与恩度联合顺铂各组中,较高浓度恩度组肿瘤直径差异低于较低浓度组。 2.3个恩度组与3个恩度联合顺铂组的淋巴转移阳性率、转移淋巴结数目及微淋巴管密度均明显低于空白对照组与顺铂组；注射较高恩度浓度的恩度联合顺铂组与恩度组淋巴转移阳性率、转移淋巴结数目及微淋巴管密度低于注射较低恩度浓度的恩度联合顺铂组与恩度组；注射相同恩度浓度的恩度联合顺铂组与恩度组间无明显差异；顺铂组淋巴转移阳性率、转移淋巴结数目及微淋巴管密度与空白对照组无明显差异。 3.3个恩度组与3个恩度联合顺铂组的VEGF-C,VEGF-D,VEGFR-3表达阳性率,微淋巴管密度均明显低于空白对照组与顺铂组；注射较高恩度浓度的恩度联合顺铂组与恩度组VEGF-C,VEGF-D,VEGFR-3表达阳性率和微淋巴管密度低于注射较低恩度浓度的恩度联合顺铂组与恩度组；注射相同恩度浓度的恩度联合顺铂组与恩度组间无明显差异；顺铂组VEGF-C,VEGF-D,VEGFR-3表达阳性率和微淋巴管密度与空白对照组无明显差异。各组微淋巴管密度与VEGF-C, VEGF-D,VEGFR-3表达阳性率存在显著正性相关关系。顺铂组,恩度1,恩度2,恩度3及恩度1+顺铂,恩度2+顺铂,恩度3+顺铂各组的循环肿瘤细胞数目明显低于空白对照组,3个恩度组与3个恩度+顺铂组中,较高浓度恩度组的循环肿瘤细胞数目低于较低浓度组,恩度联合顺铂各组的循环肿瘤细胞数目明显低于单独使用顺铂或恩度。 4.观察组患者术后12个月时出现病情复发的比例为9.5%,明显低于对照组的25.9%(p0.05)；观察组每个治疗周期的各类药物不良反应发生率与对照组发生率的差异无统计学意义(P0.05)。 5.分别于术后3个月、6个月、9个月及12个月行全身检查,包括胸、腹部CT,脑MRI,腹部超声,全身骨扫描,部分患者行PET-CT检查。对两组患者术后发生淋巴转移的情况进行比较,对照组淋巴转移率明显高于观察组。结论 1.恩度与顺铂均能抑制肿瘤生长、转移,恩度与顺铂联合使用对肿瘤生长的抑制作用强于两者单独使用； 2.恩度能够抑制肿瘤微淋巴管生成及肿瘤淋巴转移,作用大小与浓度有关,顺铂未发现类似作用； 3.恩度通过抑制肿瘤组织中VEGF-C,VEGF-D的表达,减少组织中VEGFR-3的激活,抑制VEGF-C、D/VEGFR-3信号通道,实现抑制肿瘤淋巴管生成,减少肿瘤细胞经淋巴管进入血液,从而减少循环肿瘤细胞,最终达到抑制肿瘤转移的目的,作用大小与浓度有关。与顺铂联合使用能够更有效的减少循环肿瘤细胞。 4.非小细胞肺癌患者术后给予恩度联合化疗治疗,临床效果确切,术后一年复发率降低,药物不良反应无明显增加； 5.非小细胞肺癌患者术后给予恩度联合化疗,对术后复发肿瘤的淋巴转移有一定的抑制作用,强于单纯化疗。综上所述,重组人血管内皮抑制素在动物实验与临床研究中都表现出了对肿瘤淋巴转移的抑制作用,主要机制为抑制淋巴管生成因子及其受体的表达；恩度还可以通过抑制肿瘤新生血管及淋巴管生成,抑制肿瘤通过脉管系统转移,减少外周血循环肿瘤细胞,改善患者预后；恩度与常规化疗药物联合使用时能提高对肿瘤生长的抑制作用,降低术后患者肿瘤复发率,且不增加药物毒副作用。本实验提示在肿瘤治疗研究中应该更加关注重组人血管内皮抑制素的淋巴管生成抑制作用,为肿瘤的临床治疗提供了一种新的治疗思路。
【图文】：

肿瘤组织,免疫组织化学染色,图片

图1-5-4.各组肿瘤组织经免疫组织化学染色VEGFR-3着色后的图片X200倍Figure 1-5-4. Coloring VEGFR-3 pictures of tumor tissue by IHC staining in each group 200times图1-5中每个字母代表的组别：a.空白对照组 e?恩度2 (4mg/kg)b.顺铀组（20iig) f.恩度 2 (4mg/kg) + 顺销(20 ug)c.恩度 1 (2mg/kg) g.恩度3 (6mg/kg)d.恩度 1 (2mg/kg) + 顺销（20 g) h.恩度3 (6mg/kg) + 顺销(20 u g)肿瘤组织采用免疫组织化学染色诊断，染色后组织中有VEGF-C，VEGF-D，VEGFR-3表达的部位和微淋巴管内皮细胞呈棕黄色，，随着恩度给药浓度增加，对肿瘤组织VEGF-C，VEGF-D,VEGFR_3的表达和淋巴管生成的抑制作用增强，肿瘤组织中VEGF-C，VEGF-D, VEGFR-3的表达和淋巴管生成减少，组织中染色区域相应减少。Group represention of each alphabet in figure 1-5;

裸鼠模型,图片,淋巴转移,非小细胞肺癌

第一章探讨恩度对非小细胞肺癌裸鼠模型淋巴转移的抑制作用 Tumor tissues' diagnosis used immunohistochemical staining, micro-lymphatic endothelial ceilsand tumor tissues where VEGF-C，VEGF-D, VEGFR-3 expressed showed brownish-yellow afterstaining.With increasing administration concentrations of endostar，inhibition of VEGF-C,VEGF-D, VEGFR-3 expression and lymphangiogenesis of tumor tissue enhanced, leaded toVEGF-C, VEGF-D, VEGFR-3 expression and lymphangiogenesis decrease in tumor tissue andcorresponding reduction in tissue stained area.
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R734.2

【参考文献】