机器灌流干预下肢缺血再灌注损伤的基础及转化研究

发布时间：2019-09-24 21:58

【摘要】：研究背景与目的：急性下肢缺血(Acute limb ischemia, ALI)是下肢动脉因各种原因导管腔的突然狭窄或闭塞,为普通外科危重急症,一直是血管外科具有挑战性的问题,其起病急剧,病情发展迅速,及时、快速复流是治疗的最终目标,若因各种原因错失最佳治疗时机,则会导致肢体不可逆的损伤、不仅有很高的截肢致残率,甚至可危及生命。这在很大程度上与恢复血流后再灌注损伤相关。如何干预下肢缺血再灌注损伤是近半个世纪以来基础与临床的研究热点。目前治疗主要集中在缺血复流后这一阶段,对于缺血后复流前这一窗口阶段,缺乏有效干预手段,目前研究仍主要停留在基础及前临床阶段,临床应用研究方兴未艾。控制性再灌流通过调节初始灌流的条件实现精准控制,为解决这一棘手临床问题打开一扇新的大门。已有研究表明机器灌流(Machine Perfusion,MP)通过对缺血后初始灌流期进行干预,可以显著降低下肢缺血再灌注损伤,具有巨大潜力来提高临床疗效。本研究的目的是围绕干预复流前这一时间窗,利用研发的灌流机器建立下肢缺血灌流模型,进而探究机器灌流对离体缺血下肢和在体缺血下肢的保护作用。研究方法：第一部分基于研发的灌流机器,建立动物离体和在体下肢缺血灌流模型,后进行灌流取灌流液对CK、CKMB、LDH、GLU等指标进行检测。第二部分对大鼠和家猪进行离体下肢灌流实验。手术切除下肢,将离体下肢分为机器灌流组(MP)与静态冷保存组(SCS),每组5只,机器灌流组在一定流速和压力保护模式下进行机器灌流3h；静态冷保存组静态保存3h。分别取0h、1h、3h灌流液,3h后取材,后对血清及灌流液进行CK、CKMB、GLU、LDH等指标进行检测,并对干湿重比D/W和MTT肌肉活力进行比较,检测MDA等指标以检测体内氧化／抗氧化系统失衡程度及MP灌流对其的干预作用。第三部分对大鼠在体缺血下肢进行灌流实验。手术麻醉大鼠,诱导缺血3h,期间经插管对缺血下肢实行在体机器灌流,灌流速度为1rpm,期间取灌流液,缺血3h后结束,恢复3h。后取材,对血清及灌流液进行CK、CKMB、GLU、LDH等指标检测,并对干湿重比D/W和MTT肌肉活力进行比较,检测、MDA等以评价体内氧化／抗氧化系统失衡程度及MP灌流对其的干预作用。后对所有数据进行统计分析,p0.05为有显著性差异。结果：(1)基于研发的灌流机器,成功建立了一种离体和在体缺血下肢灌流模型,灌流液的CK、CKMB、LDH、GLU等指标结果显示MP模型切实可行,具有相对稳定性。(2)离体大鼠下肢灌流实验结果显示灌流组MP在3h取得的灌流液葡萄糖水平、LDH水平、CKMB水平显著降低(P0.05); MTT结果显示MP组织活力显著高于SCS (P0.05);离体家猪下肢灌流实验结果显示MP组的MTT肌肉组织活力显著高于SCS组；MP组D/W比例明显高于SCS组；HE结果显示机器灌注能干预保护缺血肌肉组织。(3)机器干预大鼠在体急性缺血再灌注损伤,发现经机器灌流后,经右下肢缺血经机器灌流的灌流液中在灌流1h内GLU、LDH、CK、CKMB逐渐下降,在20min至40min下降明显,而灌流液的钠离子、氯离子、钾离子无明显变化。MP组MDA水平较对照组显著下降；对下肢缺血经机器灌流后的大鼠进行血液检测,发现血液的LDH水平显著降低(P0.05), CKMB下降。结论：(1)本课题成功建立大鼠离体、家猪离体下肢缺血模型,并在此基础上建立大鼠在体急性缺血下肢模型,且该模型切实可行,这将在今后进一步探讨下肢缺血再灌注损伤的基础及转化研究发展中起到重要作用。(2)通过进一步研究,本课题发现机器灌流方法可实现精准参数控制,能成功干预离体下肢缺血,减少缺血再灌注损伤。因此,机器灌流成为推动发展下肢缺血再灌注损伤治疗的新策略。(3)本课题相关机制研究证实机器灌流能进一步抑制氧自由基损伤,减小炎症细胞反应和细胞凋亡,本课题对后期进一步深入机器灌流对下肢缺血保护的相关机制研究起重要作用。(4)如何实现在体下肢缺血灌流实验成为前临床基础实验研究的重点,本课题研究显示机器灌流能成功干预动物下肢缺血再灌注损伤。因此,本课题的研究将为实现临床转化提供理论依据,并推动未来临床应用转化。
【图文】：

机器结构,再灌注损伤,灌流

图３急性下肢缺血再灌注损伤干预机器结构图逡逑鼠离体缺血下肢灌流模型逡逑成功建立了大鼠离体缺血下肢灌流模型，麻醉后沿大鼠腹巧口，切开皮肤后，对皮下脂肪组织进行分离，后精细分经，使股动静脉充分暴露，利用一次性静脉留置针对鼠股动静脉较细，术中可利用显微镜进行操作插管，插管，用生理盐水对股动脉灌流进行肝素化，抗凝保护。沿腹股沟完整离断双侧大鼠下肢。在ＩｍＬ／ｍｉｎ、３０ｍｍＨ冰浴条件下对离体缺血模型进行灌流，可见血流通畅，到灌流液；ＬＤＨ、ＣＫ、ＣＫＭＢ指标结果显示在灌流过程

趋势图,家猪,灌流,趋势

灌流条件为流量５０ｍＬ／ｍｉｎ、压力保护８０ｍｍＨｇ、４°Ｃ冰浴，灌流过程稳定，，灌流液逡逑为肾宝液５００ｍＬ，灌流期间可见持续灌出的灌流液，ＣＫ、ＣＫＭＢ、ＬＤＨ、ＧＬＵ等逡逑结果显示（图５），相对于ＳＣＳ，ＭＰ灌流模型在灌流过程中明显改善，证明该缺逡逑１０逡逑
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R654.4

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