基于MAPK信号通路研究大柴胡汤防治慢性胰腺炎的作用机制

发布时间：2019-09-27 23:58

【摘要】：【目的】采用二丁基二氯化锡（Dibutyltin dichloride,DBTC）尾静脉注射联合10%乙醇饮用建立小鼠慢性胰腺炎的模型，观察胰腺纤维化进展中MAPK信号通路的变化及大柴胡汤对其干预效应，以探讨大柴胡汤防治慢性胰腺炎胰腺纤维化的作用机制。【方法】随机将健康雄性昆明小鼠分为3组（n=90）：空白组（Control，Con组）、慢性胰腺炎(Chronic Pancreatitis，CP)模型组、大柴胡汤（Entrapementscattered DaChaiHu）治疗组。给予小鼠一次性尾静脉注射DBTC（8mg/kg），联合10%乙醇饮用诱模，于造模后三天随机将小鼠分为模型组和大柴胡汤治疗组，模型组正常饮食，10%乙醇替代正常饮水，治疗组给予大柴胡汤（0.5g生药/ml，6g/kg/d））灌胃治疗。空白组不做任何处理，常规摄食饮水作为对照。于造模及治疗第1、2、4、8周四个时间点分别麻醉处死动物，下腔静脉取血，3000rpm离心15分钟留取血清，按试剂盒方法检测血清淀粉酶（Amylase, AMS）和透明质酸（Hyaluronic acid，HA）含量。留取胰腺组织，甲醛固定、脱水透明、石蜡包埋、切片，HE染色及胶原纤维（Masson）染色观察其组织病理学改变；胰腺组织匀浆提取RNA及总蛋白，RT-PCR检测基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase, MMP)及其抑制物金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitorof metalloproteinase, TIMP)的含量；Western-blot检测I型胶原（CollagenI，colA1）、磷酸化MAPK（P-ERK、P-JNK、P-p38）的指标变化。【结果】 1.大柴胡汤对慢性胰腺炎小鼠胰腺组织病理学改变的影响 HE染色显示： DBTC尾静脉注射1w可见胰腺明显呈急性炎症的表现；2w胰腺小叶水肿，可见腺泡细胞点片状坏死及炎细胞浸润；随着造模时间的延长，，胰腺结构破坏更加明显，至4w可见纤维组织沉积，8w时胰腺纤维化明显，取代了正常的胰腺腺泡细胞及胰岛。经大柴胡汤灌胃治疗后，与同时间点模型组相比，胰腺损伤明显减轻；至8w仅有少量纤维组织沉积。胶原纤维（Masson）染色显示DBTC尾静脉注射后现少量蓝染的胶原纤维在间质中出现；随着造模时间的延长纤维化明显增加，至8w可见大量胶原纤维广泛增生，胰腺组织被纤维严重分割。大柴胡汤灌胃治疗后各时间点胰腺纤维化的程度明显减轻。 2．大柴胡汤对慢性胰腺炎小鼠血清AMS、HA、胰腺MMP/TIMP及MAPK通路的影响 DBTC尾静脉注射联合饮用乙醇后，血清AMS的活性明显升高；造模后2w、4w，血清AMS维持在较高水平，8w血清AMS水平显著降低，与对照组相比差异有显著性（P0.01）；大柴胡汤治疗组1w、2w、4w血清AMS活性明显下降,与相应时间点模型组相比有显著性差异(P0.01)，而8w血清淀粉酶活性没有出现明显下降，与模型组相比有所升高，差异存在显著性（P0.01）。DBTC尾静脉注射联合饮用乙醇2周、4周后，血清HA明显升高,8周后进一步升高，与对照组相比有显著性差异（P0.01）；大柴胡汤治疗组血清HA明显降低,与相应时间点模型组比较存在显著性差异(P0.01)。 DBTC尾静脉注射联合饮用乙醇后，模型组胰腺组织MMP-1mRNA表达持续降低，与正常组相比存在差异；经大柴胡汤灌胃治疗后小鼠胰腺MMP-1表达明显增多，与同时间点模型组比较有明显差异(P0.05)。而胰腺组织TIMP-1mRNA表达在造模2w时明显升高，4w、8w表达有所下降，但仍处于较高水平。大柴胡汤灌胃治疗后，2w、4w胰腺组织TIMP-1mRNA的表达降低，与模型组比较，具有明显差异（P0.05），但随着给药时间的延长，TIMP-1mRNA维持在一个水平，与模型8w组比较无显著性差异。空白组小鼠胰腺未见Ⅰ型胶原的表达；CP模型组各时间点胰腺组织中colA1的表达明显增强；4w表达最明显。给予大柴胡汤灌胃治疗后胰腺组织colA1的表达明显少于模型组。模型组胰腺组织中P-ERK、P-JNK、P-P38的活性表达均有不同程度增强；其中P-ERK表达增强最明显，随造模时间的延长，表达进一步增强。而大柴胡汤治疗组各时间点P-ERK表达明显减少。P-JNK在造模后1w表达明显增强，2w时表达水平下降有所减弱，但4w、8w时表达则持续增强。大柴胡汤灌胃治疗后的小鼠P-JNK表达减少，但在治疗2w时P-JNK出现逆转趋势，表达有所增加，4w、8w明显减少。P-p38在造模1w时表达增多最为明显，2w及4w表达有所降低，但8w时表达又处于较高水平。而治疗组在1w、2w、4w时P-p38的表达没有明显抑制；但是治疗8w时P-p38的表达明显降低，与模型组比较差异存在显著性。【结论】 1.采用尾静脉注射DBTC联合乙醇饮用可以建立小鼠CP模型， MAPK信号通路参与胰腺纤维化，是慢性胰腺炎的治疗靶点之一； 2.大柴胡汤能有效防治胰腺纤维化，其分子机制与调控MAPK信号通路有关。
【图文】：

病理学变化,胰腺,腺泡,急性炎症

结果 1 不同时间点胰腺组织病理学的变化如图1所示，HE结果显示正常小鼠胰腺小叶结构排列整齐，未见明显病变；尾静脉注射DBTC1天后，胰腺即有急性炎症改变。DBTC尾静脉注射1w可见胰腺间质水肿充血，腺泡细胞肿胀，炎细胞浸润主要为中性粒细胞及单核细胞，明显呈急性胰腺炎表现；CP2w组胰腺实质腺泡呈现多处不同程度的片状坏死，炎性细胞浸润有所增多，可有粘液及组织碎片在导管内沉积，腺泡可见残留的坏死组织。与2w组比较，造模后4周胰腺出现典型的不规则纤维化；部分胰腺组织结构破坏

小鼠,病理学变化,灌胃,沉积量

大柴胡汤灌胃治疗后，与同时间点模型组轻，结构有所恢复，间质中仍可见少量炎为减轻，纤维组织明显减少；8w 可见胰腺组织沉积量明显少于模型组。H&E staining ×100 造模组不同时间点胰腺组织病理学变化
【学位授予单位】：陕西中医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R259

【参考文献】