糖尿病下肢血管病变PTA后再狭窄及磺脲类药物胰腺外降糖机制的研究

发布时间：2019-10-12 00:52

【摘要】：研究背景糖尿病下肢血管病变(lower extremity peripheral arterial disease in diabetes, Diabetic LEAD)是糖尿病患者常见的慢性血管并发症,是导致糖尿病患者足部溃疡乃至下肢截肢的主要原因。球囊扩张术即经皮腔内血管成形术(percutaneous transluminal angioplasty,PTA)由于疗效确切、创伤小且术后恢复快等优点,逐渐成为糖尿病下肢血管病变的主要治疗措施。但PTA后扩张部位再狭窄(restenosis,RS)的发生,严重影响着患者的远期疗效及预后,限制了该项技术的临床应用。为预防和改善再狭窄,较大血管可以考虑采用血管内支架植入术,但糖尿病下肢血管病变范围主要集中在膝以下胫腓动脉和其分支,不适合应用支架,这致使PTA在糖尿病下肢血管病变治疗中作用更加凸显。解决PTA后再狭窄问题是提高糖尿病下肢血管病变疗效的关键,探究再狭窄发生发展机制,对今后糖尿病下肢血管病变的治疗尤为重要。由于人体中再狭窄血管组织不易获得,对于再狭窄的研究主要依赖于体外细胞培养及动物模型实验。体外研究难以充分说明再狭窄病变的机制,而目前体内的再狭窄研究也存在难点：多数研究者采用单次球囊拉伤术构建动物模型进行再狭窄相关研究,但此模型存在不足,其建立的“再狭窄”病变形成机制与人体PTA后再狭窄有差异,不能很好的模拟人体再狭窄过程。缺少理想的动物模型使再狭窄的相关研究颇具争议性,研究之间缺乏可比性且进展缓慢,建立与人下肢血管病变PTA后再狭窄过程相似的动物模型,对再狭窄发生机制及预防的研究尤为重要。本研究拟模拟人下肢血管病变PTA后血管损伤过程,对具有动脉粥样硬化病变的血管行PTA手术,以此方式建立与人下肢血管病变PTA后再狭窄相似的动物模型；同时将采用球囊拉伤术构建的动脉粥样硬化动物模型作为对照,并设定不同血糖分组对上述再狭窄与动脉粥样硬化血管斑块进行对比研究,以便于探索再狭窄与动脉粥样硬化的差异及高血糖状态对再狭窄的影响,更好的探究再狭窄发生机制。研究目的1、建立与人下肢血管病变PTA后再狭窄发病机制相似的动物模型；2、同时构建动脉粥样硬化及再狭窄动物模型,并通过设定不同血糖分组对两者血管斑块行对比研究,以探索动脉粥样硬化及再狭窄发病机制的差异及高血糖状态对再狭窄的影响,更好的探究再狭窄发生机制。研究方法1、实验分组及模型建立：(1)糖尿病再狭窄vs.非糖尿病再狭窄；(2)糖尿病动脉粥样硬化vs.非糖尿病动脉粥样硬化。选取3月龄新西兰大耳白兔(～1.7kg),使用普通饲料适应性喂养1周后,再进行高脂饲料喂养,直至实验结束。随机将实验兔分为4组：①糖尿病再狭窄组：a.四氧嘧啶80mg/kg于耳缘静脉注射以建立1型糖尿病模型(实验第1周),b.球囊拉伤术建立髂动脉粥样硬化模型(实验第2周),c.超声检测球囊拉伤部位,观察拉伤部位动脉粥样硬化斑块形成情况(手术结束4周,实验第6周),d.对髂动脉粥样硬化斑块形成部位行PTA手术(实验第6周),建立再狭窄模型；②非糖尿病再狭窄组：a.生理盐水于耳缘静脉注射(实验第1周),b.球囊拉伤术建立髂动脉粥样硬化模型(实验第2周),c.超声检测球囊拉伤部位,观察拉伤部位动脉粥样硬化斑块形成情况(手术结束4周,实验第6周),d.对髂动脉粥样硬化斑块形成部位行PTA手术(实验第6周),建立再狭窄模型；③糖尿病动脉粥样硬化组：a.四氧嘧啶80mg/kg于耳缘静脉注射建立1型糖尿病模型(实验第1周),b.超声检测髂动脉血管通畅状况(实验第6周),c.球囊拉伤术建立髂动脉粥样硬化模型(实验第6周)；④非糖尿病动脉粥样硬化组：a.生理盐水于耳缘静脉注射(实验第1周),b.超声检测髂动脉血管通畅状况(实验第6周),c.球囊拉伤术建立髂动脉粥样硬化模型(实验第6周)。2、糖化血红蛋白检测：实验结束留取动物血样标本测定糖化血红蛋白。3、标本获取及病理学检测：再狭窄及动脉粥样硬化模型建立后观察28天,对动物进行安乐死,建模部位血管取材,10%中性甲醛固定,脱水、石蜡包埋后切片。①HE染色观察血管大体形态,② Masson染色观察平滑肌及胶原,③EVG染色观察弹力纤维。应用Image-Pro Plus 5.0图像分析系统测量建模部位血管斑块的内膜厚度、中膜厚度、血管总面积,内膜及中膜面积等指标,并计算狭窄率、内膜／中膜比值。应用增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、α-actin及CD68抗体,分别对建模部位血管斑块内增殖细胞数目、平滑肌细胞含量及巨噬细胞含量进行测定。4、统计学分析所有数据用mean±SD表示,使用SPSS 20.0统计学软件分析实验数据,两组间比较采用非配对t检验。P0.05被认为有统计学意义(双侧),P0.01被认为有显著统计学意义(双侧)。研究结果1、动物一般情况各组实验兔随机血糖基线水平一致。糖尿病组实验兔耳缘静脉注射四氧嘧啶1周后,糖尿病模型成功率～66.7%。实验结束前,2只糖尿病动脉粥样硬化组实验兔及1只糖尿病再狭窄组实验兔死于高血糖；2只非糖尿病动脉粥样硬化组实验兔及1只非糖尿病再狭窄组实验兔死于超声检查；1只非糖尿病再狭窄组实验兔及2只糖尿病动脉粥样硬化组实验兔死于血栓。2、各组实验兔体重及血糖情况各组实验兔体重在开始实验及结束实验时水平大致相同,均无明显差异(P0.05)。建模前各组实验兔之间血糖水平无差异,四氧嘧啶注射1周后糖尿病组实验兔整体血糖水平升高,直至实验结束均明显高于非糖尿病组,有统计学意义(P0.05)；相同血糖类型模型下的实验兔血糖之间无差异(糖尿病再狭窄组vs.糖尿病动脉粥样硬化组,P0.05；非糖尿病再狭窄组与非糖尿病动脉粥样硬化组,P0.05)。实验结束对各组实验兔糖化血红蛋白进行检测,其结果同各组血糖所反映的状况一致。3、超声检测结果实验第6周对各组实验兔髂动脉部位行超声检测,糖尿病及非糖尿病再狭窄组全部实验兔髂动脉球囊拉伤部位均可见低回声斑块；糖尿病及非糖尿病动脉粥样硬化组实验兔相应部位血管内膜光滑,腔内未见异常回声,提示血管无狭窄。实验结束前(第10周),超声检测各组实验兔建模部位血管,均可见斑块形成。4、各组建模部位血管狭窄率及内膜／中膜面积结果各组实验兔髂动脉建模部位均可见斑块形成。其中,糖尿病动脉粥样硬化组血管狭窄率明显高于非糖尿病动脉粥样硬化组(P0.05)；然而,糖尿病再狭窄组实验兔建模部位血管狭窄率与非糖尿病再狭窄组之间却未见明显差异(P0.05),两组实验兔髂动脉建模部位均严重狭窄。再狭窄组建模部位血管中膜较动脉粥样硬化组薄,其中中膜层最薄的为糖尿病再狭窄组,中膜层最厚的为非糖尿病动脉粥样硬化组。两再狭窄组实验兔建模部位血管内膜／中膜面积之间无差异(糖尿病再狭窄组vs.非糖尿病再狭窄组,P0.05)；两动脉粥样硬化组实验兔建模部位血管内膜／中膜面积之间有差异(糖尿病动脉粥样硬化组vs.非糖尿病动脉粥样硬化组,P0.05)。5、斑块组成成分及细胞增殖状况结果特殊染色结果显示：再狭窄血管内弹力纤维断裂,中膜内有动脉粥样硬化斑块内膜成分嵌入；血管斑块大部分表现为典型的圆形及向心性损伤,也有少数为非典型形状损伤；新生的内膜中少见泡沫细胞。两动脉粥样硬化组实验兔血管斑块成分和特征与他人相关实验研究结果一致。Masson、α-actin及CD68免疫组织化学染色结果显示：糖尿病再狭窄组及非糖尿病再狭窄组实验兔髂动脉斑块处满布平滑肌细胞,巨噬细胞含量低,两组之间差异不明显；两动脉粥样硬化组实验兔血管斑块内平滑肌细胞较少见,但巨噬细胞含量高,其中糖尿病动脉粥样硬化组斑块内巨噬细胞含量升高明显,高于非糖尿病动脉粥样硬化组。PCNA检测细胞增殖能力结果显示：糖尿病再狭窄组及非糖尿病再狭窄组斑块内PCNA阳性细胞率均明显增高,两组之间无明显差异(P0.05)；再狭窄组PCNA阳性细胞率比动脉粥样硬化组高；糖尿病动脉粥样硬化组斑块内PCNA阳性细胞率高于非糖尿病动脉粥样硬化组(P0.05)。研究结论1、本研究通过模拟人下肢血管病变PTA后血管损伤过程,对具有动脉粥样硬化病变的血管行PTA手术,成功建立与人下肢血管病变PTA后再狭窄相似的理想动物模型。2、高糖虽是动脉粥样硬化斑块形成的独立风险因素,对再狭窄的发生、发展却影响不大,造成这种差异的主要原因可能是动脉粥样硬化与再狭窄发生机制的不同。3、动脉粥样硬化斑块主要为炎性病变引起,而再狭窄斑块形成机制主要是血管平滑肌细胞从中膜迁移到内膜并剧烈增殖,对再狭窄血管中平滑肌细胞迁移增殖的研究是防治PTA后再狭窄的重点。研究背景再狭窄(Restenosis，RS)严重影响着糖尿病下肢血管病变(lower extremity peripheral arterial disease in diabetes，Diabetic LEAD)患者经球囊扩张术(percutaneous transluminal angioplasty，PTA)治疗后的远期效果，探究影响再狭窄病变的因素对糖尿病下肢血管病变PTA治疗尤为重要。降糖药物是糖尿病患者常规治疗措施，然而临床研究发现糖尿病患者所使用的降糖药物影响再狭窄发生率。磺脲类药物(Sulfonylureas，SUs)是临床常用口服降糖药物之一，据统计现约有70%的糖尿病患者采用SUs治疗。有研究发现SUs与再狭窄发生有关，但具体机制不明，有关研究较少。众所周知，SUs在体内主要通过促进胰腺胰岛素分泌以降低血糖，其机制是结合胰岛β细胞膜表面ATP敏感性钾(ATP-sensitive potassium，KATP)通道的磺脲类受体1(sulfonylurea receptorl，SUR1)，关闭KATP通道。近年来，许多研究发现SUs还具有胰腺外作用，是当前研究的热点。研究发现，磺脲类受体(SUR)不仅存在于胰岛β细胞，还广泛分布于心脏(SUR2A)及血管平滑(SUR2B)等部位，而SUs可以结合胰腺外组织器官的SUR，调控相应部位KATP通道。目前已有研究显示胰腺外组织KATP通道开关状态可影响细胞功能及代谢等生理病理过程。我们的前期研究结果(I部分)与其他相关研究达成一致共识：再狭窄主要是由血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)大量迁移增殖造成的，VSMCs迁移增殖调控是PTA介入治疗后再狭窄研究的关键。SUs通过结合SURs关闭KArp通道起作用，而SURs中SUR2B亚型在VSMCs中广泛表达。因此，SUs是否可通过结合VSMCs上SUR2B关闭细胞KATP通道，调控VSMCs的迁移增殖?目前国内外未见相关报道。本研究中，我们拟首先于体外培养VSMCs，采用不同SUs对其处理，观察不同SUs对VSMCs迁移增殖的影响；并对处理后VSMCs上KATP通道开关状态进行调控，探究SUs是否可通过胰腺外关闭KATP通道作用，影响VSMCs的迁移增殖，并探究不同SUs对VSMCs迁移增殖调控机制；最后分析不同SUs对VSMCs调控作用在其再狭窄影响中的角色。研究目的1、在体外细胞水平，研究不同SUs对VSMCs增殖及迁移能力的影响。2、探究不同SUs对VSMCs迁移增殖调控机制。3、分析SUs对VSMCs迁移增殖调控作用在其对再狭窄影响中的角色。研究方法1、人主动脉平滑肌细胞(HA-VSMC)培养及分组：HA-VSMC细胞株购自美国ScienCell公司，取第4-6代应用于后续实验。实验分组如下：①Control组；②格列美脲组；③格列本脲组；④格列齐特组。2、免疫荧光方法检测HA-VSMC细胞株SUR2表达采用细胞免疫荧光法，检测HA-VSMC膜表面SUR2的表达。3、SUs药物剂量选取分别测定3种SUs(格列美脲、格列本脲及格列齐特)对HA-VSMC活力的影响，计算并选择3种SUs对HA-VSMC同等活力影响的药物浓度用于后续实验研究。4、细胞增殖及迁移能力检测①对体外培养的HA-VSMC经空白、格列美脲、格列本脲、格列齐特处理24小时，利用CCK-8细胞增殖检测试剂盒对各组HA-VSMC增殖能力进行检测，明确3种SUs对HA-VSMC增殖的影响。②空白、格列美脲、格列本脲及格列齐特干预体外培养的HA-VSMC 24小时，利用Transwell小室对各组细胞迁移能力进行检测。明确3种SUs对HA-VSMC迁移的影响。③为进一步研究，再分别于各实验组中加入100μM二氮嗪(KATP通道开放剂)重复上述实验步骤，检测开放KATP通道后，格列美脲、格列本脲及格列齐特对体外培养的HA-VSMC迁移增殖能力的影响。5、免疫印迹分析(western blot)提取蛋白，利用western blot检测p-NF-κ3-p65表达，β-actin作为内参。6、统计学分析全部数据用mean±SE表示，使用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，两组间比较采用非配对t检验。P0.05被认为有统计学意义(双侧)，P0.01被认为有显著统计学意义(双侧)。研究结果1、免疫荧光方法对HA-VSMC细胞株SUR2表达检测：HA-VSMC细胞表面有丰富的SUR2表达。2、SUs药物剂量选取结果对格列美脲、格列本脲及格列齐特处理的HA-VSMC活力进行检测并计算其抑制率，取ICl0进行后续实验：格列美脲浓度为208~tM、格列本脲21μM、格列齐特2000μM。3、细胞增殖能力检测结果采用上述选定的药物浓度检测格列美脲、格列本脲及格列齐特对VSMCs增殖影响，与对照组相比，格列美脲及格列本脲组HA-VSMC细胞增殖增多，促增殖；格列齐特组则HA-VSMC细胞增殖减少，抑增殖。加入二氮嗪后，格列美脲及格列本脲由之前的促进HA-VSMC增殖转变为抑增殖，分别计算各组细胞生长抑制率为：格列美脲组(12.36±1.15)%，格列本脲组(5.96±0.58)%，格列齐特组(17.49±0.1)%，与对照组相比均具有显著统计学意义(P0.01)，同时将三种SUs对HA-VSMC增殖影响结果两两比较发现，各组间比较均有统计学差异。4、细胞迁移实验结果Transwell小室结果显示：格列美脲、格列本脲组HA-VSMC迁移数目增多(格列美脲：vs.对照组，P0.05；格列本脲：vs.对照组，P0.01)，，促HA-VSMC迁移；格列齐特则抑制HA-VSMC迁移，计数HA-VSMC迁移数目减少(vs.对照组，P0.05)。加入二氮嗪后，格列美脲及格列本脲组HA-VSMC迁移细胞数目减少，低于对照组，由促HA-VSMC迁移变为抑制其迁移作用。5、格列齐特通过NF-κB通路调控VSMCs生物学功能NF-κ3信号通路在再狭窄VSMCs迁移增殖调控中起着关键作用，我们通过western blot对磷酸化NF-κ3亚基p65(p-NF-κB-p65)进行检测，结果显示，经格列齐特处理的HA-VSMC，p-NF-κB-p65表达降低，加入PMA(浓度1μM，激活NF-rd3通路)后，可拮抗格列齐特对HA-VSMC迁移及增殖的抑制作用。研究结论1、不同SUs对VSMCs迁移增殖的影响不同，在本实验所选取的常用SUs中，格列本脲和格列美脲对VSMCs的迁移及增殖起到促进的作用，格列本脲的促进作用更为显著，格列美脲次之，KATP通道开关状态在其中扮演着重要角色。2、格列齐特对VSMCs迁移增殖表现为抑制作用，机制可能与其SUR选择性，及在VSMCs上调控NF-κB通路的活性相关。研究背景磺脲类药物(Sulfonylureas，SUs)是2型糖尿病治疗中最常用的口服降糖药物之一，是胰岛素促泌剂的一种，其通过作用于胰岛β细胞表面的磺脲类受体1(sulfonylurea receptorl，SUR1)，促胰岛素分泌，发挥降低血糖的作用。目前有研究显示，除胰腺胰岛β细胞外，SUs还可以作用于体内多个器官靶点，影响多个生理病理过程，具有胰腺外作用，其中胰腺外降糖作用是研究热点之一。SUs可通过此作用实现对血糖的进一步调控，因此，虽然指南强调在起始胰岛素强化治疗方案时要停用SUs，但仍然有不少医生将胰岛素强化治疗和SUs联合应用。然而，目前有关SUs胰腺外降糖作用的证据多是体外研究，体内研究中未能排除/未考虑SUs促胰岛B细胞分泌胰岛素的影响。有实验通过采用生长抑素抑制亦或是应用具有高胰岛素血症的KK鼠弱化SUs介导的胰岛素分泌，对SUs的胰腺外降糖作用进行体内研究及证实，但上述方法均不能实现对SUs促胰岛素分泌作用的完全阻断，无法明确证实体内SUs胰腺外降糖作用的存在。因此，所谓的SUs“胰腺外降糖作用”是由未被完全阻断的SUs介导的胰岛素分泌所导致的，还是体内确实存在胰腺外降糖作用?目前尚不清楚。这在很大程度上限制了SUs的临床应用。明确SUs胰腺外降糖作用的存在，亟须具有说服力的体内研究进行证实。不同的SUs胰腺外作用存在差异，格列齐特属于第二代SUs，较之其他SUs，因其结构中含有一氮杂环而具备许多特殊功能，比如在血管平滑肌细胞(vascularsmooth muscle cells，VSMCs)中格列美脲和格列本脲通过结合SUR2B促其迁移增殖，而没有作用位点的格列齐特则通过调控NF-κB抑制其迁移增殖，表现出不同的胰腺外作用(第一部分)。目前有研究显示格列齐特在改善血糖方面，同样存在胰腺外作用，但缺乏有力证实，本研究中以格列齐特为代表，对SUs胰腺外降糖作用进行研究。为确证格列齐特体内胰腺外降糖作用的存在，本研究拟将大鼠SURl基因敲除，构建SURl~大鼠模型。在该模型中，格列齐特胰岛β细胞作用受体(SURl)缺失，其介导的促胰岛β细胞分泌胰岛素作用被完全阻断。在此基础上建立2型糖尿病模型并给予药物刺激，即可观察格列齐特对胰腺外组织的直接影响，明确其胰腺外降糖作用及机制。同时我们选取不通过结合SURl促胰岛素分泌发挥降糖作用的药物——二甲双胍作为标准药物对照组，以便更好的对格列齐特的胰腺外降糖作用进行对比观察。研究目的1、阐明格列齐特体内胰腺外降糖作用的存在。2、探究格列齐特胰腺外降糖作用的机制。研究方法1、SUR1基因敲基因大鼠的构建及培养：构建SUR1基因敲除大鼠(TALEN基因敲除技术)。并通过筛选和育种，获取SUR1-/-大鼠。2、2型糖尿病模型建立及实验分组健康雄性SUR1-/-大鼠，体重～120g左右。高脂饲料喂养，4周后行腹腔葡萄糖耐量试验(intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)及胰岛素耐量试验(intraperitoneal insulin tolerance test，IPITT)，选取建立胰岛素抵抗的SURl~鼠给予腹腔一次性注射27.5mg/kg链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)。继续高脂喂养2周后测定空腹血糖，连续两次空腹血糖≥11.1mmol/l，且伴有多饮、多食、多尿症状的大鼠被认为建模成功。成功建立2型糖尿病的SUR1-/-鼠再次行IPGTT及IPITT检测，并随机分为3组：①格列齐特组(Gliclazide组，10mg/kg/d)；②二甲双胍组(Metformin，212.5mg/kg/d)；③对照组(Control组)。通过灌胃的方式给药，Control组给予生理盐水灌胃，喂药时间2周。2周后重复IPGTT及IPITT检测，并对各组实验鼠行高胰岛素-t常血糖钳夹实验，钳夹结束后将动物安乐死，取材。3、血糖与体重：测定①用药前、②用药后1周、③用药结束，各组实验鼠空腹血糖及体重，并记录。4、IPGTT及IPITTIPGTT:实验鼠禁食12小时后，以葡萄糖1g/kg剂量，对其进行腹腔注射，使用血糖仪分别测定Omin、15min、30min、60min及120min尾静脉血血糖，将测量的各个时间点血糖绘制成曲线，计算曲线下面积(areas under curve，AUC)。IPITT：实验鼠禁食4小时后，胰岛素1U/kg，腹腔注射，使用血糖仪分别测定0min、15rain、30min、60min及120min尾静脉血血糖，绘制曲线，计算AUC。5、高胰岛素-正常血糖钳夹实验每组分别取6只实验鼠，在钳夹实验前1周采用戊巴比妥钠将其麻醉，于左侧股动脉置管，并将所置入的导管从颈背部引出、固定，以防止实验鼠撕咬。置管大鼠禁食16小时后开始高胰岛素.正常血糖钳夹实验。①采用26G留置针穿刺尾静脉并接入三通，此为同时输注胰岛素及葡萄糖的通道；②1周前置入的股动脉管作为采血通道。首先采集空腹血，并通过血糖仪测定空腹血糖数值，输注胰岛素(10mU/kg/min)及葡萄糖(随时调整输注速度)，每5min测一次血糖并对其进行调整，待1小时左右将血糖稳定在～6.0mmol/l，将各时间点葡萄糖输注速度做好详细记录。实验结束后，将大鼠安乐死并取材。6、标本的留取：钳夹实验结束，大鼠麻醉，心脏灌注后取肝脏、股四头肌肉及附睾处脂肪，取材后将一部分组织固定于10%中性甲醛中，24小时后脱水并石蜡包埋；一部分包埋于OCT中；剩余部分组织液氮速冻，-80℃冰箱保存。7、组织病理学检查及免疫荧光染色检查：应用periodic acid-Schiff(PAS)染色方法使5μm厚度肝脏石蜡切片糖原显色；应用葡萄糖转运子4(glucose transporter 4，GLUT4)抗体测定OCT包埋61μm厚度冰冻切片肌肉及脂肪组织中GLUT4表达及分布情况。8、免疫印迹(western blot)检测：取冻存于.80℃的新鲜肝脏、肌肉及脂肪组织，分别提取总蛋白及膜蛋白，应用Akt、p-Akt、AMPK、p-AMPK抗体测定肝脏Akt及AMPK磷酸化激活程度，应用GLUT4、PPAR-7、Akt、p-Akt、AMPK、p-AMPK测定肌肉及脂肪组织中总GLUT4、膜GLUT4、PPAR-7表达水平及Akt 及AMPK磷酸化激活程度。9、统计学分析使用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，全部数据均用mean±SE表示，两组间比较采用非配对t检验。P0.05(双侧)被认为有统计学意义，P0.01(双侧)被认为有显著统计学意义。研究结果1、SURl敲基因大鼠构建及SUR1-/-鼠培育：Abcc8(SUR1)基因敲除，成功构建TALEN载体、线性化载体并倒入胚胎干细胞、成功筛选同源重组的胚胎干细胞、通过显微注射方式将胚胎干细胞导入囊胚、成功获取嵌合体大鼠并与野生型大鼠杂交获取杂合体大鼠、再次杂交获取SUR1-/-大鼠。采用PCR、Sanger测序及western blot方法证实SURF-/-大鼠获取成功。2、动物一般情况大鼠喂养高脂饲料4周后，经测定全部产生胰岛素抵抗。STZ注射后，共27只大鼠血糖达到2型糖尿病模型建立标准，血糖未达标的大鼠被排除出实验。格列齐特组及对照组分别有1只实验鼠在实验未完成前死亡，死因不详。3、各组实验鼠体重及血糖情况①体重：二甲双胍组实验鼠体重轻微下降，但与对照组相比无统计学差异(P0.05)，对照组及格列齐特组大鼠体重实验前后无明显改变。②空腹血糖情况：各组实验鼠用药前空腹血糖基线数值一致。用药2周后，各组空腹血糖出现明显差异。格列齐特组大鼠与对照组相比，空腹血糖降低，有统计学意义(P0.05)，但其降低程度较二甲双胍组要弱(P0.01)。证实格列齐特有胰腺外降糖作用。③IPGTT：各组实验鼠用药前IPGTT基线数值无差异。用药2周后，与对照组相比二甲双胍组IPGTT AUC下降明显，有显著统计学意义(P0.01)，然而格列齐特组IPGTTAUC虽有降低，但与对照组之间无统计学差异(P0.05)。提示格列齐特有胰腺外调节糖代谢的能力，但较弱。④IPITT.各组实验鼠用药前IPITT基线数值无差异。用药2周后，与对照组相比较格列齐特组大鼠胰岛素注射后，血糖曲线下降明显，但是不如二甲双胍组显著。对各组胰岛素耐量改善状况进行排序：二甲双胍组格列齐特组对照组。提示格列齐特有缓解胰岛素抵抗作用。4、高胰岛素一正常血糖钳夹实验高胰岛素-]E常血糖钳夹实验，采用血糖稳定后，即钳夹60-120分钟葡萄糖输注率(GIR)平均值来反映全身葡萄糖利用情况。格列齐特组大鼠GIR升高(vs.对照组，P0.05)；但比二甲双胍组低(P0.05)。明确格列齐特具有胰腺外缓解胰岛素抵抗作用，但其缓解胰岛素抵抗能力弱于二甲双胍。5、肝脏胰岛素抵抗改善结果①肝脏糖原染色结果肝脏是机体糖代谢的主要器官，肝脏产生胰岛素抵抗可明显升高机体血糖。肝糖原储备降低是肝脏胰岛素抵抗的主要表现之一。为了检测SURl基因敲除后格列齐特对大鼠肝脏中糖原储备的影响，我们对各组大鼠肝脏组织切片并行PAS染色，发现格列齐特虽然不如二甲双胍能够强烈的增加肝糖原的含量，但是有直接增加肝糖原储备的作用(vs.对照组)。②肝脏组织Akt、AMPK磷酸化激活情况肝脏组织磷酸化/总Akt显示Akt磷酸化激活情况，结果示：与对照组相比较，格列齐特可提高肝脏Akt的激活程度(P0.05)，二甲双胍则表现为显著激活肝脏Akt(P0.01)；与二甲双胍组相比较，格列齐特组肝脏Akt激活程度较弱(P0.05)。肝脏组织磷酸化/总AMPK显示AMPK磷酸化激活情况，结果示：格列齐特不能激活肝脏AMPK(vs.对照组，P0.05)；二甲双胍则明显激活肝脏AMPK(vs.对照组，P0.01；vs.格列齐特组，P0.05)。6、肌肉及脂肪组织胰岛素抵抗改善结果①肌肉及脂肪组织总GLUT4及膜GLUT4表达检测外周组织葡萄糖代谢障碍是胰岛素抵抗的另一主要表现。葡萄糖摄取是糖代谢过程中主要限速步骤，而肌肉(骨骼肌)及脂肪组织则介导了大部分胰岛素刺激的葡萄糖摄取。GLUT4是肌肉及脂肪组织摄取葡萄糖的主要载体。我们对各组实验鼠股四头肌及附睾处脂肪组织总GLUT4及膜GLUT4(GLUT4表达在膜上介导葡萄糖的摄取)检测发现：a.免疫荧光染色显示：格列齐特组肌肉及脂肪细胞胞浆及胞膜处GLUT4均明显增加；二甲双胍组GLUT4表达较格列齐特组弱，仅于部分胞膜处荧光可见；对照组GLUT4荧光最弱。b.western blot结果显示：在肌肉组织中，与对照组比较，格列齐特组总GLUT4及膜GLUT4表达均显著增加(总GLUT4：vs.对照组，P0.01；膜GLUT4：vs.对照组，P0.01)；二甲双胍组，总GLUT4无明显变化，但膜GLUT4表达增加(总GLUT4：vs.对照组，P0.05；膜GLUT4.vs.对照组，P0.01)；格列齐特组与二甲双胍组膜GLUT4表达无明显差异(P0.05)。在脂肪组织中，与对照组及二甲双胍组相比较，格列齐特组总GLUT4及膜GLUT4表达增加(P0.05)；二甲双胍不增加脂肪组织总GLUT4及膜GLUT4的表达(总GLUT4-vs.对照组，P0.05；膜GLUT4-vs.对照组，P0.05)。②肌肉及脂肪组织Akt激活情况肌肉组织磷酸化/总Akt显示Akt激活，结果示：格列齐特组肌肉组织Akt激活明显，是对照组的1.75倍，有统计学意义(vs.对照组，P0.01)；二甲双胍对Akt激活增强作用在肌肉组织中稍弱，是对照组的1.41倍，有统计学意义(vs.对照组，P0.01)。在脂肪组织中，格列齐特组脂肪组织Akt磷酸化激活明显(vs.对照组，P0.05)，二甲双胍组脂肪中Akt不激活(vs.对照组，P0.05)，格列齐特组与二甲双胍组相比较，Akt激活明显(P0.05)。③肌肉及脂肪组织AMPK激活情况不同于二甲双胍显著激活肌肉及脂肪组织AMPK，格列齐特不激活肌肉及脂肪组织AMPK(vs.对照组，P0.05)。④肌肉及脂肪组织PPAR-γ检测格列齐特能明显促进SURF-/-大鼠肌肉组织中PPAR-γ表达，与对照组相比较，格列齐特组PPAR-γ表达量提高了1.47倍(P0.01)；与二甲双胍组相比较，格列齐特促PPAR-γ表达也较明显(P0.05)。在脂肪组织中，格列齐特促进PPAR-7表达的作用更加显著，是对照组的4.61倍(vs.对照组，P0.01)，且高于二甲双胍组脂肪组织中PPAR-γ的表达量(P0.05)。研究结论1、格列齐特除传统的促胰岛β细胞分泌胰岛素降糖作用外，还具有胰腺外降糖作用。2、格列齐特胰腺外改善血糖代谢及胰岛素抵抗的能力较二甲双胍弱，其胰腺外降糖作用机制与二甲双胍不同，二甲双胍主要是缓解肝脏组织胰岛素抵抗，格列齐特则主要是缓解肌肉及脂肪组织胰岛素抵抗。3、格列齐特能明显促肌肉及脂肪组织中GLUT4的表达及转位，其作用机制可能与PPAR-y及Akt通路激活有关。SUs一直被认为是通过胰岛素促泌作用来降低血糖，缓解糖尿病患者病情。本研究通过将SUs胰岛β细胞上作用受体基因——SURl敲除，SURl表达缺失，SUs促胰岛素分泌作用被阻断，观察第二代SUs——格列齐特对SURl基因敲除后2型糖尿病大鼠的影响。证实格列齐特在失去促胰岛β细胞分泌胰岛素降糖能力后，仍然可以直接作用于外周组织，缓解胰岛素抵抗状况，改善糖代谢。明确其同时具有促胰岛素分泌降糖及缓解胰岛素抵抗降糖两方面作用，为今后的用药指导提供依据。
【图文】：

图１．兔骼动脉再狭窄模型手术示意图及各手术时间点超声图

图２．建模２８天各实验组建模部位血管超声图像。逡逑Ａ：非糖尿病动脉粥样硬化组实验兔血管超卢图；Ｂ：糖尿病动脉粥样硬化组实验兔血管超逡逑声图；Ｃ：非糖尿病再狭窄组实验兔血管超卢图；Ｄ：糖尿病巧狭窄实验兔血管超卢图逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2


本文编号：2547781