补肾疏肝方对肺腺癌A549细胞凋亡及Notch信号通路研究

发布时间：2019-12-02 23:11

【摘要】：背景与目的：根据世界卫生组织公布的资料显示，肺癌不论是发病率还是死亡率均居全球癌症的首位，肺癌中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占80%左右，目前主要的治疗措施有手术、放疗、化疗及生物治疗等。虽然某些早期肺癌患者能达到治愈的效果，但是绝大部分患者被确诊时已到中晚期，大部分失去了手术机会。近几年来，中医中药对肿瘤影响得到了国内外医药界的关注，尤其是在中医药诱导细胞凋亡方面具有重要意义。中西医结合的方法治疗肿瘤不论在临床上还是在科研上都得到广泛的应用和推广。补肾疏肝方是导师多年的经验用方，在临床上能使患者病灶范围缩小，病情得到显著控制，使患者的生活质量得到明显的提高，延长患者的生存期限。本实验通过血清药理学的方法，基于“补肾疏肝方”治疗非小细胞肺癌的临床疗效，进一步探究该复方中药对肺癌的疗效及作用机制，为临床应用提供更有利的实验依据。方法：选取60只SD大鼠均为雄性，采取随机分配的原则，分为6组（每组10只，组间体重无差异）：分别是对照组、顺铂组、补肾疏肝方低、中、高剂量组、联合组（补肾疏肝方中剂量联合DDP）。中药浓度的设置是根据灌胃药物所用的剂量为正常成年人浓度的10倍。对照组的大鼠采用灌胃的方式给予4ml/天生理盐水；DDP组的大鼠通过腹腔注射的方式每只给予2ml（0.5mg/ml）DDP，隔天给药，共给药3天；补肾疏肝方低剂量组的大鼠采用灌胃方式给予4ml/天的低剂量中药（含生药1.25g/ml共计5g）；补肾疏肝方中剂量组的大鼠通过灌胃给予中药4ml/天（含生药2.5g/ml共计10g）；补肾疏肝方高剂量组的大鼠通过灌胃给予中药4ml/天（含生药3.75g/ml共计15g）。联合组给予中剂量灌胃药液4ml/天灌胃及腹腔注射2ml的DDP（浓度0.5mg/ml），在第1、3、5天注射。最后一次灌胃2h后用10%水合氯醛腹腔注射的方式麻醉大鼠，从腹主动脉采血保证无菌防治污染，，样品静置2h后，用离心机离心20min，3000r/min分离血清，在56℃的水浴箱中灭活30min，用0.22μm微孔过滤器过滤除菌，放在-20℃冰箱保存备用。制备大鼠含药血清，MTT法检测补肾疏肝方含药血清对非小细胞肺癌A549细胞增殖的影响。Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测补肾疏肝方含药血清对A549细胞凋亡率的影响。PI单染法流式细胞仪检测补肾疏肝方含药血清对A549细胞周期的影响。Western-Blot检测补肾疏肝方含药血清对P53，Bcl-2蛋白表达的影响。半定量RT-PCR检测补肾疏肝方含药血清对Notch信号通路的影响。结果： 1.倒置显微镜下观察，补肾疏肝方含药血清作用A549细胞48h，可见对照组的A549细胞生长状态良好；而中剂量组的细胞变小，细胞间隙稍微增大，少部分细胞断裂破碎，悬浮在培养液中。高剂量组多数细胞悬浮，少量贴壁细胞变圆形或断裂成碎片，细胞数量明显减少，DDP组与高剂量组显微镜下大致相同。联合组的细胞大量脱落、破碎，呈凋亡状态。补肾疏肝方含药血清作用于A549细胞72h后细胞凋亡最为显著。 2. MTT法检测不同浓度的补肾疏肝方含药血清作用于A549细胞不同时间的抑制功能。结果显示随着补肾疏肝方含药血清浓度的增加，处理时间的延长，其抑制作用呈明显的剂量-时间依赖效应，与DDP联合作用效果最为显著，其24h，48h，72h联合组的抑制率分别为26.71%、30.86%、41.74%。 3.流式细胞仪检测补肾疏肝方含药血清作用于A549细胞72h细胞周期和凋亡率的改变：随着补肾疏肝方含药血清浓度的增加G2/M期细胞百分比增加，以联合组G2/M期细胞百分比最高（P＜0.05）；用流式细胞仪检测细胞凋亡率，结果显示不同浓度的补肾疏肝方含药血清作用于A549细胞时，细胞的凋亡率均高于对照组，差异有统计学意义（P0.05）；联合组与对照组比较有显著差异（P0.01），凋亡率最高达38％。 4. Western Blot检测补肾疏肝方含药血清对P53，Bcl-2表达的影响。补肾疏肝方含药血清作用于A549细胞72h不仅能激活P53还能下调凋亡抑制蛋白Bcl-2，以联合组最为显著。补肾疏肝方低、中、高、联合组、DDP组与对照组BCL-2、P53灰度值比较均有差异（P＜0.05）。 5. RT-PCR法检测补肾疏肝方含药血清对Notch1、Delta4、VEGF mRNA的表达影响：补肾疏肝方含药血清作用于A549细胞72h可抑制Notch1、Delta4、VEGF基因的表达， Notch1、Delta4、VEGF基因mRNA相对表达量结果显示，高剂量组、DDP、联合组与对照组比较有差异（P＜0.05），DDP组和联合组对A549细胞的作用最明显。结论： 1．补肾疏肝方对A549细胞的抑制呈现时间-剂量依赖方式，以联合组作用最为显著。 2．补肾疏肝方阻滞非小细胞肺癌A549细胞在G2/M期，减慢细胞的增殖速度，并诱导细胞的凋亡。 3．补肾疏肝方可能是通过下调Bcl-2蛋白表达量，激活P53蛋白表达量诱导细胞凋亡。 4.补肾疏肝方诱导A549细胞的凋亡也可能与抑制Notch1、Delta4、VEGF基因表达有关。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R285.5

【参考文献】