生长激素对肝脏胰岛素信号的时间效应及其与胰岛素抵抗的关系

发布时间：2019-12-05 05:26

【摘要】：研究背景生长激素(growth hormone,GH)是人体的重要激素,在机体的生长、发育、代谢和衰老等过程起着重要的作用。随着80年代生物工程技术的进步,重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH)合成成功。从而,生长激素的临床应用逐渐普及,从最初的仅用于治疗儿童生长激素缺乏症(growth hormone deficiency,GHD),扩展到特发性矮小(idiopathic short stature,ISS)、宫内生长迟缓、先天性卵巢发育不全综合征(Turner syndrome,TS)、严重烧伤、脓毒症、急性重症胰腺炎、炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)、慢性肾脏病等。然而,随着重组人生长激素的广泛应用,其安全性问题越来越受到广泛关注。其短期治疗少有不良反应,而长期应用则会出现各种负面效应,例如胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)、肿瘤等。研究显示胰岛素抵抗与多种代谢性疾病的发生发展密切相关,如糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)、肥胖、非酒精性脂肪肝、高血压等。近来还有研究发现,胰岛素抵抗与多种消化系肿瘤如肝癌、结直肠癌、胰腺癌等也存在密切关系。胰岛素信号是机体代谢调节的重要信号,主要包括MAPK/ERK和PI3K/Akt两条通路,前者主要涉及细胞生长和增殖,实现基因的转录调控；后者则与多种代谢调控有关。P13K由两个亚基组成,一个是调节亚基p85,一个是催化亚基p110。PI3K/Akt通路可被多种细胞因子激活,如在SPC-A1细胞中表皮生长因子(epidermal growth hormone,EGF)可使PI3K/Akt通路激活。正常情况下,胰岛素与受体(insulin receptor,IR)结合,引起自身磷酸化,激活胰岛素受体底物-1(insulin receptor substrate,IRS-1),酪氨酸残基磷酸化的IRS-1与p85亚基结合,进而激活p110亚基,活化的PI3K使磷脂酰肌醇4,5二磷酸(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate,PI(4,5)P2)转化成磷脂酰肌醇3,4,5三磷酸(PI(3,4,5)P3)。PIP3使Akt/PKB发生变构从而被激活。活化的Akt通过各种下游信号调控细胞代谢、增殖、分化与凋亡。因此,上述信号通路中的任一环节受到抑制或者被阻断都可导致宏观上葡萄糖转运受阻即胰岛素抵抗。肝脏是生长激素最重要的靶器官,生长激素参与的通路主要包括JAK2/STAT5、MAPK/ERK和PI3K/Akt通路。有研究报道,生长激素可以对胰岛素PI3K/Akt通路有不同效应的作用,并能诱导胰岛素抵抗。虽然,有关研究已有不同的报道,然而,这些研究并没有明确地研究生长激素对胰岛素信号的时间效应关系,更没有对这种时间效应进行动物水平和细胞水平的比较研究。因此,为了更好地了解其机制,本课题同时比较在动物水平和细胞水平上,生长激素对胰岛素信号作用的时间效应。有报道称生长激素和胰岛素能共享PI3K/Akt通路,那么生长激素诱导肝脏的胰岛素抵抗是否与内源性胰岛素分泌有关,是否是两者相互作用共同导致的,也是本课题所要探讨的问题。第一部分不同时间点生长激素对肝脏胰岛素信号的影响 [目的] 本部分内容在细胞培养水平和动物模型上,研究生长激素作用不同时间情况下对肝脏胰岛素信号的效应。 [方法] 1.细胞试验：本课题选择人肝癌细胞HepG2。培养液为DMEM(含10%胎牛血清)。细胞血清饥饿12小时后,再用生长激素(2μg/ml)分别刺激4小时和30分钟,裂解前都行10分钟的胰岛素(0.15IU/ml)刺激,RIPA裂解液裂解细胞,提取蛋白。 2.动物试验：6-8周龄Balb/c雄性小鼠48只随机分成6组：3w rhGH组、3w control组、4h rhGH组、4h control组、30min rhGH组、30min control,每组8只。重组人生长激素腹腔注射浓度为1μg/g体重,对照注射等体积无菌生理盐水。小鼠处死前10分钟或腹腔注射胰岛素(recombinant human insulin,rhINS)(2IU/kg体重),或对照注射等体积无菌生理盐水。戊巴比妥钠充分麻醉处死小鼠,摘取肝脏,液氮速冻后,-80℃冰箱存放备检。 3.蛋白信号分子的测定肝组织冰上研磨,RIPA裂解液裂解,提取蛋白。与HepG2细胞蛋白一起用免疫印迹法(western blot,WB)检测Akt磷酸化水平。 4.统计分析采用SPSS13.0软件和Excel2003分析。实验数据以“算术平均值±标准差(arithmetic mean±standard deviation,M±SD)’表示。两组间方差齐性采用两独立样本t检验(Independent-Samples T Test),方差不齐则采用Satterthwaite近似t检验。各组间比较采用方差分析(One-Way ANOVA),方差齐性的多重比较采用Bonferroni检验,方差不齐采用Dunnett'T检验。P值0.05定义为有显著差异,有统计学意义。 [结果] 1.体外研究(细胞培养试验)中不同时间点生长激素刺激的效应：检测结果显示,胰岛素刺激后,与对照组(灰度值：1.327±0.089)相比,30min rhGH刺激使HepG2细胞p-Akt水平(1.463±0.031)略有增加,但差异不明显(p=0.104)；而4h rhGH刺激则使HepG2细胞p-Akt水平(0.929±0.048)显著降低(p=0.001)。 2.体内研究不同时间点生长激素的效应： A)小鼠处死前10分钟,注射外源胰岛素,以检测肝脏Akt磷酸化变化。western blot结果显示：30min rhGH组、4h rhGH组小鼠肝脏p-Akt信号与各自对照组相比(30min组：1.046±0.0892vs1.103±0.170；p=0.411；4h组：1.035±0.085vs1.134±0.147；p=0.121),均无明显变化；而3w rhGH处理的小鼠,其肝脏p-Akt水平(0.494±0.206)与其对照组(1.046±0.329)相比显著降低(p=0.001)。 B)小鼠处死前,无外源胰岛素的注射,以检测小鼠内源性胰岛素信号激活的Akt磷酸化变化。western blot结果显示：30min rhGH组(1.108±0.332)小鼠肝脏p-Akt信号较对照组(0.218±0.055)显著增强(p=0.000);4h rhGH组(0.803±0.179)与4h control组(0.701±0.052)相比,小鼠肝脏p-Akt信号无明显变化(p=0.14)；而3w rhGH组(0.949±0.445)小鼠肝脏p-Akt信号较其对照组(1.950±0.552)显著减弱(p=0.000)。 [结论] 1.在细胞培养水平,短时生长激素刺激能促进胰岛素信号激活,而长期刺激则能抑制胰岛素信号； 2.在健康小鼠模型中,短时生长激素刺激能促进基础的p-Akt信号的激活,随着时间延长逐渐变化成抑制效应; 3.在健康小鼠模型中,短时生长激素刺激对外源胰岛素刺激下的p-Akt激活没有明显影响,但长期刺激则能抑制胰岛素p-Akt信号。 4.生长激素对肝脏胰岛素信号的变化进程在体内水平(In vivo)比细胞水平(In vitro)的慢,首次揭示了以前报道的体内环境中生长激素刺激对胰岛素的效应可能不仅是两激素间的作用,而是众多激素共同作用的效果。第二部分长期生长激素诱导健康及1型糖尿病小鼠肝内胰岛素抵抗 [目的] 前述实验发现在细胞及动物水平,生长激素刺激随时间延长均能抑制胰岛素PI3K/Akt信号。然而,长期生长激素刺激可以诱导肝内胰岛素抵抗,是否与自身胰岛素分泌有关?如果破坏了小鼠的胰岛素,长期生长激素是否仍然可以诱导胰岛素抵抗? [方法] 1.链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)建立1型糖尿病小鼠模型6-8周龄Balb/c雄性小鼠禁食8小时后称重并测量空腹血糖。连续3天予腹腔注射STZ(120g/kg体重)。3天后测量空腹血糖、体重,空腹血糖≥11.1mmol/L认为1型DM造模成功进入下一步实验。 2.成模小鼠随机分为STZ+rhGH组和STZ+control组,STZ+rhGH组同前述3w rhGH组,每天予腹腔注射rhGH(1μg/g体重),STZ+control组同3w control组予等体积无菌生理盐水,连续3周。4组小鼠注射完最后1次生长激素和生理盐水后禁食8小时测量体重及空腹血糖。次日7：00处死,处死前10分钟每组随机抽取一半小鼠予腹腔注射重组人胰岛素(recombinant human insulin,rhINS)(2IU/kg体重),另一半小鼠注射等体积无菌生理盐水对照。心脏采血备ELISA试剂盒检测小鼠血浆胰岛素浓度。采血后快速摘取肝脏组织液氮速冻,-80℃冰箱保存。 3.人肝癌细胞HepG2种植于细胞培养板,含10%胎牛血清的DMEM培养基培养,血清饥饿12小时后,按照实验方案给rhGH(2ug/ml)和胰岛素(0.15IU/ml)刺激,RIPA裂解液裂解收集细胞提取蛋白。 4.蛋白信号分子的测定肝组织研磨,RIPA裂解液裂解,提取蛋白o western blot检测Akt磷酸化水平。 5.统计分析分析方法同上。 [结果] 1.连续注射STZ3天后,其中19只小鼠的血糖≥11.1mmol/L,随机抽取16只进入下一步实验。 2.连续注射3周重组人生长激素后,3w rhGH组和3w control组小鼠体重均有增加,但3w rhGH组小鼠体重增加幅度较其对照组(6.850g±1.303g vs3.800g±0.660g,p=0.001)显著增加；而STZ+rhGH组和STZ+control组小鼠体重均有明显下降,但STZ+rhGH组体重减轻幅度显著低于STZ+control组(1.686g±1.111g vs3.878g±1.810g,p=0.008). 3.胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)=[空腹胰岛素(mU/L)×空腹血糖(mmol/L)]/22.5.连续3周重组人生长激素注射后,3w rhGH组、STZ+rhGH组分别和各自对照组比较,血糖变化无显著差异(3w组：4.483m mol/L±0.331m mol/L vs4.417m mol/L±0.319m mol/L,p=0.73;STZ组：18.500m mol/L±3.390m mol/L vs20.040mmol/L±5.988m mol/L,p=0.63).血浆ELISA结果显示,3w rhGH组小鼠空腹血浆胰岛素水平较对照组显著增加(8.845mU/L±3.542mU/L vs3.158mU/L±2.418mU/L, p=0.009);STZ+rhGH组小鼠空腹血浆胰岛素水平较对照组也显著增加(9.468mU/L±3.559mU/L vs3.719mU/L±2.705mU/L, p=0.021)因而3w rhGH组小鼠和对照组相比,胰岛素抵抗指数显著升高(1.736±0.635vs0.631±0.496,p=0.007); STZ+rhGH组小鼠和对照组相比,胰岛素抵抗指数显著升高(7.873±3.784vs3.078±2.413,p=0.044) 4.小鼠Western blot检测结果显示,STZ+rhGH组、3w rhGH组分别和各自对照组相比,无论基础还是胰岛素激发后,Akt磷酸化水平均有显著降低(基础：1.385±0.301vs3.199±0.994,p=0.013；胰岛素激发后：0.470±0.509vs1.002±0.572,p=0.041)。 5.HepG2细胞的western blot检测结果显示,与对照组(灰度值：0.895±0.060)相比,4h rhGH组(0.353±0.053)、4h rhGH+30min insulin组(0.265±0.060)p-Akt信号均显著下降(p0.001)；但4h rhGH+30min insulin组和4h rhGH组p-Akt信号比较无明显差异(p=0.462) [结论] 1.长期生长激素可以诱导健康小鼠胰岛素抵抗,也可以诱导1型糖尿病小鼠胰岛素抵抗； 2.细胞水平上,30分钟胰岛素模拟内源性胰岛素分泌,无论有无内源胰岛素刺激,生长激素均能抑制胰岛素信号,说明生长激素诱导胰岛素抵抗与内源性胰岛素无关,或各有不同机制。
【图文】：

条形图,体重下降,幅度比,小鼠

图2-2: 1型糖尿病小鼠3周rhGH注射后STZ+rhGH组和对照组的体重下降幅度比较。条形图的误差线表示平均值±标准误。Figure 1-1: 3 weeks' rhGH decreased weight loss in mice with STZ-induce 1 type DM. Thevalues in bars were displayed as means 士 standard errors.41
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R587.1

【参考文献】