IL-8对乳腺癌干细胞的影响及其作用机制

发布时间：2020-02-08 19:54

【摘要】：研究背景：:乳腺癌是女性最高发的恶性肿瘤之一，全球每年约新增138万名乳腺癌患者，占女性新发肿瘤的30%。并且近年来的研究发现，乳腺癌的发病有年轻化的趋势。并已成为威胁女性生命的“头号杀手”。乳腺癌是一种全身性疾病，早期手术是最主要的治疗方法，而化疗和放疗是晚期患者治疗的重要策略。肿瘤细胞的化疗耐药或放疗抵抗是乳腺癌临床治疗的主要障碍，而肿瘤的复发和转移是导致乳腺癌患者治疗失败和引起癌症病人生活质量下降及死亡的主要原因。目前研究认为，肿瘤干细胞是肿瘤不断生长及复发转移的根源,肿瘤微环境在调控肿瘤干细胞的自我更新、多向分化及耐药等过程中发挥重要作用。深入研究肿瘤微环境中的信号分子及其传导通路对肿瘤干细胞的调控机制，可为制定新的治疗策略有效靶向肿瘤干细胞，减少肿瘤复发转移提供理论依据。近年来，一种促炎细胞因子，CXC趋化因子8（CXCL8，又名白细胞介素8，interleukin8，IL-8），在肿瘤的发生发展中的作用引起了研究者的高度关注。目的：了解乳腺癌干细胞IL-8及其受体特别是IL-8受体1（CXCR1）的表达情况；进一步探索外源性高表达IL-8对乳腺癌干细胞的影响及其作用机制，为乳腺癌的防治提供实验依据。方法：首先，利用磁珠分选出乳腺癌MCF-7细胞中CD44+/CD24-和非CD44+/CD24-两组细胞，实时定量PCR、ELISA或Western Blot法检测IL-8及其受体CXCR1的表达情况。然后，利用分子克隆技术构建高表达IL-8的真核表达载体（pcDNA3.1/myc-HisC-IL-8重组质粒）；利用脂质体法将重组质粒瞬转到MCF-7细胞，转染后24h收集细胞及其培养上清，qRT-PCR和ELISA方法检测IL-8在MCF-7细胞中的过表达，Western Blot检测IL-8受体CXCR1表达的变化。进一步利用CCK-8实验、Transwell体外侵袭和迁移实验了解IL-8高表达对MCF-7细胞的增殖、迁移及侵袭能力的影响。最后，通过成球实验了解MCF-7细胞高表达IL-8后乳腺癌细胞乳腺球形成能力的变化，流式细胞仪检测CD44+/CD24-和非CD44+/CD24-两组细胞所占比例的变化Western Blot检测乳腺癌干细胞标记物如ALDH1、BMI1表达的变化；同时，将高表达IL-8的MCF-7细胞接种裸鼠，观察裸鼠肿瘤生长情况；接种后第21天,麻醉后取裸鼠外周血,ELISA法检测IL-8水平的变化，取荷瘤裸鼠肿瘤组织，Western Blot检测肿瘤组织中IL-8受体CXCR1、ALDH1及BMI1表达的变化,免疫组织化学检测ALDH1表达的变化。结果： 1．利用磁珠从乳腺癌MCF-7细胞中分选出CD44+/CD24-和非CD44+/CD24-两群细胞后，ELISA检测发现CD44+/CD24-细胞分泌的IL-8量明显高于非CD44+/CD24-细胞，而qRT-PCR结果显示在mRNA水平上CD44+/CD24-细胞的IL-8的表达低于非CD44+/CD24-细胞。qRT-PCR和Western Blot检测证实在mRNA和蛋白水平上CD44+/CD24-细胞IL-8受体CXCR1的表达显著高于非CD44+/CD24-细胞。 2．利用分子克隆技术构建高表达IL-8的真核表达载体（pcDNA3.1/myc-HisC-IL-8重组质粒），并用脂质体法将重组质粒瞬时转染到MCF-7细胞中，并用qRT-PCR和ELISA法证实转染后细胞IL-8mRNA和蛋白表达均升高。进一步通过WesternBlot证实转染后细胞IL-8受体CXCR1的表达也增加。 3．pcDNA3.1/myc-HisC-IL-8重组质粒转染MCF-7细胞后，CCK8法检测发现外源性高表达IL-8对乳腺癌MCF-7细胞的增殖能力没有明显影响；在Transwell侵袭实验中穿过基质胶的MCF-7细胞数分别为：IL-8转染组：（247.3±17.6）个/高倍镜视野，无关序列组：（76.7±3.1）个/高倍镜视野,空白对照组：（86.3±7.4）个/高倍镜视野；在Transwell迁移实验中穿过小室基底膜的细胞数分别为：IL-8转染组：（255.3±22.7）个/高倍镜视野,无关序列组：（105.3±7.1）个/高倍镜视野，空白对照组：（126.7±11.6）个/高倍镜视野，提示，高表达IL-8的乳腺癌MCF-7细胞的迁移和侵袭能力显著高于转染无关序列或空白对照的MCF-7细胞，差别具有统计学意义（p0.05）。 4．高表达IL-8的乳腺癌MCF-7细胞形成乳腺球的体积、乳腺球的数量明显高于空白对照组和无关序列组；流式细胞仪检测发现高表达IL-8的乳腺癌MCF-7细胞中CD44+/CD24-比例为16.39%±0.56%，明显高于空白对照组和转染无关序列组的MCF-7细胞,其CD44+/CD24-的细胞比例分别为6.39%±0.59%，5.28%±1.1%；WesternBlot检测发现高表达IL-8的乳腺癌MCF-7细胞乳腺癌干细胞标记物ALDH1及BMI1的表达明显高于空白对照组和转染无关序列组细胞，提示高表达IL-8不但可上调乳腺癌MCF-7细胞中的干细胞数量而且还能增强其“干性”标志物。进一步体内研究发现：裸鼠接种等数量的转染IL-8或转染无关序列的MCF-7细胞后，转染IL-8的荷瘤裸鼠肿瘤的生长速度明显快于转染无关序列的荷瘤裸鼠。接种后第21天，转染IL-8的荷瘤裸鼠外周血中IL-8水平显著高于转染无关序列的荷瘤裸鼠，同时，转染IL-8荷瘤裸鼠的瘤重为（4.93±0.3）g，显著高于转染无关序列荷瘤裸鼠的瘤重（2.28±0.39）g，差异具有统计学意义（P0.05）；Western Blot检测证实转染IL-8后荷瘤裸鼠肿瘤组织中IL-8受体CXCR1的表达显著高于转染无关序列的荷瘤裸鼠；免疫组织化学检测发现转染IL-8的荷瘤裸鼠肿瘤组织ALDH1的表达明显高于转染无关序列的荷瘤裸鼠，且Western Blot证实转染IL-8后荷瘤裸鼠肿瘤组织IL-8受体CXCR1及乳腺癌干细胞的相关蛋白ALDH1及BMI1显著高于转染无关序列的荷瘤裸鼠。结论： 1．乳腺癌CD44+/CD24-干细胞可分泌IL-8并表达IL-8受体CXCR1。 2．外源性高表达IL-8在乳腺癌细胞IL-8受体CXCR1的表达水平也增高，伴有乳腺癌细胞迁移及侵袭能力的增强，同时乳腺癌细胞中CD44+/CD24-干细胞的数量、成球能力及干细胞相关蛋白ALDH1及BMI1的表达亦显著增高，明显促进荷瘤裸鼠肿瘤的生长。
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.9

【共引文献】