左、右归丸及其拆方调节去卵巢大鼠脂质代谢的研究

发布时间：2017-03-21 08:05

  本文关键词：左、右归丸及其拆方调节去卵巢大鼠脂质代谢的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:本实验从中医“阴阳互济”理论出发,选取中医滋阴补肾填精代表方剂左归丸和温阳补肾填精代表方剂右归丸,并将其拆方,以两方的共有药为共同药组,以左归丸中的滋阴药为滋阴方组,右归丸中的补阳药为补阳药组,探讨左、右归丸及其拆方对去卵巢大鼠脂质代谢紊乱的防治作用和作用机制,并探讨肾精亏虚与绝经后女性脂质代谢紊乱的关系。材料与方法:选用SPF级2月龄雌性未生育SD大鼠90只,体重200~220g,按体重分层,随机平均分为:正常组(Control)、假手术组(SHAM)、模型组(OVX)、阳性对照药补佳乐组(BJL)、左归丸组(ZGW)、右归丸组(YGW)、共同药组(GTY)、滋阴药组(ZYY)、补阳药组(BYY),去卵巢组按0.3 m L·100 g-1体重腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉后,无菌环境下行背部手术拆除双侧卵巢,假手术组按相同方法只摘除卵巢周围适量脂肪组织,正常组不做任何处理。术后,各组大鼠正常饮水,第2天开始自由饮食,术后1周称量大鼠体重并开始给药,给药治疗后每隔4周称量1次体重。依据每公斤体重大鼠给药量为人的6.3倍计算,折算出各给药组的每日灌胃生药量为:BJL为0.09 mg·kg-1,ZGW为9.45 g·kg-1,YGW为10.26 g·kg-1,GTY为7.56 g·kg-1,ZYY为6.48 g·kg-1,BYY为4.05 g·kg-1,以上各中药方均自制成水煎剂,阳性对照药补佳乐用蒸馏水自制成混悬液,各给药组均灌服相应药物,正常组、假手术组、模型组均给予蒸馏水(每100g体重灌胃1m L)。给药治疗12周后取材,除去实验过程中因手术、灌胃死亡的动物,结果共纳入76只实验动物。取材前24 h禁食不禁水,末次给药2 h后称重,按0.3 m L·100 g-1体重腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉后,用负压管行腹主动脉取血,静置2 h后离心取血清,一部分用于全自动生化分析仪检测血清总胆固醇(Total cholesterol,TC)、甘油三酯(Triglycerides,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(Low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(High density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase,AST);一部分分装后-80℃储存,用于酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked immunoabsorbent assay,ELISA)检测血清雌二醇(Estradiol,E2);取大鼠新鲜肝脏,并称量湿重,以备计算大鼠肝脏指数,然后取大鼠肝脏前叶,多聚甲醛浸泡数周后制成石蜡切片,以备HE染色肝脏形态学检测;取大鼠肝脏中叶放入无菌EP管中于-80℃冻存,用于制备冰冻切片,进行油红染色,显微镜下观察去卵巢大鼠肝脏脂肪堆积情况,分光光度法测定肝组织匀浆脂质过氧化物(Lipid peroxide,LPO)、过氧化氢(Peroxide,H2O2)的含量、TBA法测丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的含量,羟胺法、酶促法、可见光法测肝组织匀浆总超氧化物歧化酶(Total superoxide dismutase,T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-PX)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)的活性,取大鼠肝后叶,一部分放入无菌EP管中冻存于-80℃,用于实时荧光定量PCR(Real-Time Quantitative RT PCR,Q-PCR)法检测肝组织中脂蛋白酯酶(Lipopro-tein lipase,LPL)、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(Perxisome proliferators-receptor-γ,PPAR-γ)的基因表达情况和蛋白印迹法(Western Blot,WB)检测大鼠肝组织LPL、PPAR-γ的蛋白表达情况,一部分多聚甲醛浸泡数周后制成石蜡切片,用于肝脏中LPL、PPAR-γ免疫组化阳性表达的检测。结果:1.左、右归丸及其拆方对去卵巢大鼠血清E2的影响与正常组比,假手术组E2水平接近正常组,模型组E2水平明显降低(p0.01),其他各组无显著性差异(p0.05);与模型组比,各治疗组均可升高E2水平(p0.01或p0.05);与左归丸组比,补佳乐组升高E2水平的效果优于左归丸,但是差异无统计学意义(p0.05),右归丸组、共同药组、滋阴药组、补阳药组升高E2水平的效果不及左归丸组(p0.05)。2.左、右归丸及其拆方对去卵巢大鼠体重、血脂、肝脏脂质代谢的影响各组大鼠起始体重没有差异,从造模后第1周开始,与正常组比较,模型组大鼠体重开始升高(P0.05),说明去卵巢后大鼠体重增加;第5周时,与正常组比较,模型组、共同药组、滋阴药组、补阳药组大鼠体重升高(p0.01或p0.05),与模型组比较,补佳乐组、左归丸组大鼠体重降低(p0.01或p0.05);第9周时,与正常组比较,模型组、滋阴药组、补阳药组大鼠体重升高(p0.01或p0.05),与模型组比较,补佳乐组、左归丸组、右归丸组大鼠体重降低(p0.01或p0.05);第13周时,与正常组比较,模型组、补佳乐组、共同药组、滋阴药组、补阳药组大鼠体重升高(p0.01或p0.05),与模型组比较,补佳乐组、左归丸组、右归丸组大鼠体重降低(p0.01或p0.05),说明左、右归丸对去卵巢大鼠体脂的增加有一定的抑制作用。与正常组比,模型组血清TC、TG、LDL-C显著升高(p0.01),假手术组接近正常组,其他各组均有所升高,但无显著性差异(p0.05),模型组血清HDL-C明显降低(p0.01),假手术接近正常组,其他各组均有所降低,但无显著性差异(p0.05);与模型组比,补佳乐组、左归丸组、右归丸组均可显著降低血清TC、TG(p0.01或p0.05),各治疗组均可显著降低血清LDL-C(p0.01或p0.05),各治疗组均可显著升高血清HDL-C(p0.01),各给药组间无显著性差异(p0.05)。左、右归丸及其拆方对去卵巢大鼠血脂均有一定的调节作用,其中左归丸、右归丸效果最好,左归丸效果虽优于右归丸,但差异无统计学意义。肝脏油红染色结果显示,正常组和假手术组有较少量油红着色,脂肪堆积不明显,模型组有比较多的油红着色,模型组肝脏脂肪堆积比正常组明显增加,补佳乐组、左归丸组、右归丸组油红着色较少,脂肪堆积不明显;与模型组比,共同药组、滋阴药组、补阳药组肝脏油红着色也有所减少,脂肪堆积明显减少。去卵巢大鼠肝脏堆积增加,左、右归丸及其拆方均可减少肝脏脂肪堆积,其中左归丸和右归丸效果较好。3.左、右归丸及其拆方对去卵巢大鼠肝脏指数的影响与正常组比,假手术组肝脏指数接近正常组,模型组、共同药组、滋阴药组、补阳药组肝脏指数均显著升高(p0.01或p0.05),补佳乐组、左归丸组、右归丸组也有所升高,但差异无统计学意义(p0.05);与模型组比,各治疗组均可显著降低肝脏指数(p0.01);其中各给药组间无显著性差异(p0.05)。4.左、右归丸及其拆方对去卵巢大鼠肝脏组织形态学影响正常组和假手术组可见肝脏组织结构正常,肝细胞排列规整,形态清晰,核膜完整,核仁清晰可见,血窦开中央静脉,中央静脉管腔大小正常;模型组中央静脉和肝细胞形态、结构变形,肝细胞排列层次稍紊乱,肝细胞形态不清晰,镜下可见少量炎性因子,血窦变小,中央静脉管腔变小;补佳乐组、左归丸组、右归丸组、共同药组、滋阴药组、补阳药组肝脏组织形态结构明显改善,肝细胞排列规整,形态清晰,核膜完整,核仁清晰,血窦开中央静脉,中央静脉管腔大小接近正常。5.左、右归丸其拆方对去卵巢大鼠肝脏抗氧化能力的影响与正常组比,模型组LPO含量明显升高(p0.01),假手术组、补佳乐组、左归丸组、右归丸组、共同药组、滋阴药组、补阳药组无显著性差异(p0.05),模型组、右归丸组、共同药组、滋阴药组、补阳药组MDA含量明显升高(p0.01),其他各组无显著性差异(p0.05),模型组、共同药组、滋阴药组、补阳药组H2O2含量明显升高(p0.05或p0.01),其他各组无显著性差异(p0.05);与模型组比,各治疗组LPO、MDA、H2O2含量均降低(p0.05或p0.01);与左归丸组比,补佳乐组降低LPO、MDA、H2O2的效果与左归丸组无显著性差异(p0.05),右归丸组、共同药组、滋阴药组、补阳药组降低LPO、MDA、H2O2的效果均不及左归组(p0.05或p0.01)。与正常组比,模型组T-SOD、GSH-PX活性明显降低(p0.05或p0.01),补佳乐组、左归丸组T-SOD、GSH-PX活性明显升高(p0.01),其他各组无显著性差异(p0.05),模型组CAT活性明显降低(p0.01),左归丸组CAT活性明显升高(p0.01),其他各组无显著性差异(p0.05);与模型组比,各治疗组T-SOD、GSH-PX、CAT活性均升高(p0.05或p0.01);与左归丸组比,补佳乐组升高T-SOD、GSH-PX、CAT活性的效果与左归丸组无显著性差异(p0.05),右归丸组、共同药组、滋阴药组、补阳药组升高T-SOD、GSH-PX、CAT活性的效果均不及左归丸组(p0.01)。6.左、右归丸其拆方对去卵巢大鼠肝功能的影响与正常组比,血清ALT、AST明显升高(P0.01);与模型组比,各治疗组均可降低血清ALT、AST(p0.01或p0.05),各治疗组间无显著性差异(p0.05),说明左、右归丸及其拆方对去卵巢大鼠肝功能有一定的改善作用。7.左、右归丸及其拆方对去卵巢大鼠肝脏脂质代谢调控因子基因蛋白表达的影响免疫组化方法检测蛋白表达结果显示:LPL、PPAR-γ在肝脏组织中呈区域性阳性表达,并且有阳性表达的肝细胞胞浆、胞核中均见阳性表达,但胞核阳性表达弱于胞浆。正常组和假手术组肝脏组织中可见较多量的肝细胞具有阳性表达,有较多的棕黄色着色,模型组肝脏组织中可见较少量的肝细胞具有阳性表达,有较少量的棕黄色着色,经药物治疗后,补佳乐组、左归丸组、右归丸组肝脏组织中具有阳性表达的肝细胞的数量明显增加,接近正常组,共同药组、滋阴药组、补阳药组肝脏组织中具有阳性表达的肝细胞的数量也有所增加,但不如左、右归丸组增加明显。Q-PCR方法检测m RNA表达结果显示:与正常组比,模型组LPL m RNA表达下调,模型组PPAR-γm RNA表达下调,补佳乐组、左归丸组、右归丸组PPAR-γm RNA表达上调(p0.01),其他组无显著性差异(p0.05);与模型组比,假手术组、补佳乐组、左归丸组、右归丸组、共同药组、滋阴药组、补阳药组LPL、PPAR-γm RNA表达均上调(p0.01);与左归丸组比,补佳乐组、右归丸组上调LPL、PPAR-γm RNA表达的效果与左归丸组无显著性差异(p0.05),共同药组、滋阴药组、补阳药组上调LPL、PPAR-γm RNA表达的效果不及左归丸组(p0.01)。Western blot方法检测蛋白表达结果显示:与正常组比,模型组LPL蛋白表达下调,模型组PPAR-γ蛋白表达下调,补佳乐组、左归丸组、右归丸组PPAR-γ蛋白表达均上调(p0.05或p0.01),其他组无显著性差异(p0.05);与模型组比,假手术组、补佳乐组、左归丸组、右归丸组、共同药组、滋阴药组、补阳药组LPL、PPAR-γ蛋白表达均上调(p0.01);与左归丸组比,补佳乐组、右归丸组上调LPL、PPAR-γ蛋白表达的效果与左归丸组无显著性差异(p0.05),共同药组、滋阴药组、补阳药组上调LPL、PPAR-γ蛋白表达的效果不及左归丸组(p0.01)。结论:1.大鼠去除双侧卵巢后,雌激素水平低下,体重增加,血脂升高,肝脏脂肪堆积明显,成功模拟绝经后脂质代谢紊乱;左、右归丸及其拆方均能升高去卵巢大鼠的雌激素水平,并改善去卵巢大鼠的脂质代谢;其中在升高去卵巢大鼠雌激素方面,左归丸效果优于右归丸、共同药、滋阴药、补阳药,在改善去卵巢大鼠脂质代谢方面,左归丸、右归丸效果优于共同药、滋阴药、补阳药,防治绝经后女性脂质代谢紊乱可用补肾填精法,并且滋阴补肾,温阳补肾的药物配伍应用,效果优于单纯的滋阴补肾和单纯的温阳补肾。2.大鼠去除双侧卵巢后,肝脏组织形态发生改变,肝脏的抗氧化能力降低,肝功能下降;左、右归丸及其拆方均能改善去卵巢大鼠肝脏组织形态,增强去卵巢大鼠的肝脏抗氧化能力,改善去卵巢大鼠的肝功能,其中在增强去卵巢大鼠肝脏抗氧化能力方面,左归丸效果优于右归丸、共同药、滋阴药、补阳药。3.大鼠去除双侧卵巢后,肝脏LPL、PPAR-γ基因与蛋白的表达水平下降,左、右归丸及其拆方均可通过上调去卵巢大鼠肝脏LPL、PPAR-γ基因与蛋白的表达水平改善去卵巢大鼠的脂质代谢,其中左、右归丸效果优于共同药、滋阴药、补阳药。4.肾精亏虚是绝经后脂质代谢紊乱的病因病机之一。
【关键词】：左归丸 右归丸 去卵巢 脂质代谢 肝脏抗氧化
【学位授予单位】：辽宁中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R285.5
【目录】：

• 摘要5-10
• 英文摘要10-18
• 英文缩略语18-20
• 前言20-22
• 论文一 左、右归丸及其拆方对去卵巢大鼠脂质代谢的影响22-43
• 材料与方法24-30
• 实验结果30-38
• 讨论38-42
• 小结42-43
• 论文二 左、右归丸及其拆方对去卵巢大鼠肝脏抗氧化能力及肝功能的影响43-60
• 材料与方法45-48
• 实验结果48-56
• 讨论56-59
• 小结59-60
• 论文三 左、右归丸及其拆方对去卵巢大鼠肝脏LPL、PPAR-γ 基因与蛋白表达的影响60-80
• 材料与方法61-70
• 实验结果70-77
• 讨论77-79
• 小结79-80
• 结论80-81
• 本研究创新性的自我评价81-82
• 参考文献82-87
• 附图87-88
• 综述88-96
• 参考文献92-96
• 个人简介96-97
• 在学期间科研成绩97-98
• 致谢98

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本文编号：259294