氯化血红素（Hemin）对新生大鼠七氟烷吸入所致神经损伤的作用及机制的研究

发布时间：2020-03-29 00:17

【摘要】：目的:每年都有成千上万的婴幼儿接受全身麻醉。全身麻醉是否对儿童的神经发育和认知功能产生不良影响是近年来备受关注的话题,也存在争议。许多临床前研究表明,麻醉剂会引起发育期的神经损伤,突触可塑性及神经细胞凋亡,并影响成人学习和记忆功能。越来越多的临床和实验研究表明,麻醉剂会引起大脑的认知功能障碍和形态学改变,特别是当它们用于未成熟和老年大脑时。虽然几种可能的机制已经被提出,包括氧化损伤和神经细胞凋亡,但神经毒性的具体机制仍不十分清楚。许多研究也一直致力于能够减轻麻醉药神经毒性的方法。Hemin是血红素氧化的产物,也称为氯化血红素、氯化卟啉铁和亚铁血红素,能够诱导血红素氧化酶活性,具有广泛的生物学功能。一般认为氯化血红素具有神经保护作用,可以诱导脑红蛋白(Ngb)的表达。脑红蛋白也有神经保护的作用,抵抗缺血/缺氧损伤,并抑制神经细胞凋亡。Hemin的神经保护作用在脑缺血和创伤性脑损伤中已成为关注热点。然而,hemin对麻醉药引起的神经毒性的作用和机制尚未阐明。尽管研究表明七氟烷能引起线粒体动力学的改变,但hemin对七氟烷引起的线粒体动力学改变的影响尚不清楚,因此,在本实验中,我们研究了七氟烷神经毒性的线粒体机制以及hemin是否可以缓解新生大鼠七氟烷暴露所致的认知功能障碍。Hemin是HO-1的底物和诱导剂,HO-1也具有神经保护作用。Hemin通过诱导Nrf2依赖性抗氧化剂,如血红素加氧酶-1(HO-1)、硫氧还蛋白-1(TRX-1)和过氧还蛋白-2(PRX-2)发挥其神经保护作用。Hemin可以防止自由基引起的损伤,降低兴奋性氨基酸毒性,对重要器官缺氧缺血性损伤具有重要的保护作用。但hemin是否通过PI3K/Akt途径参与新生鼠七氟烷神经毒性的保护作用仍不十分清楚。所以我们通过脑室注射PI3K/Akt的特异性抑制剂LY294002(LY)来研究PI3K/Akt途径是否参与hemin神经保护的过程。同时用Western blot检测Ngb,caspase-3,Akt,pAkt,HO-1及SOD的变化来观察hemin对七氟烷毒性的保护作用的其他可能机制。研究方法:7日龄健康SD大鼠84只,体重16-18g。将新生大鼠随机分为4组;(1)对照组(C组):仅腹腔注射生理盐水,并吸入40%氧气和60%氮气的混合气体。(2)氯化血红素给药组(H组),在生后第5天和第6天腹腔注射hemin(50mg·kg~(-1));(3)S组:吸入3%的七氟烷约(1.5MAC)4小时,吸入氧浓度40%,氮气60%。(4)SH组中吸入3%的七氟烷4小时,并在生后第5天和第6天腹腔注射hemin(50mg·kg~(-1))。抑制剂组分组:7日龄健康SD大鼠24只,体重16-18g。将生后七天的新生大鼠随机分为4组;(1)对照组(C组):仅腹腔注射生理盐水,并吸入40%氧气和60%氮气的混合气体。(2)氯化血红素给药组(H组),在生后第5天和第6天腹腔注射hemin(50mg·kg~(-1));(3)SH组中吸入3%的七氟烷4小时,并在生后第5天和第6天腹腔注射hemin(50mg·kg~(-1))。(4)SHI组中吸入3%的七氟烷4小时,并在生后第5天和第6天腹腔注射hemin(50mg·kg~(-1)),同时在麻醉前两小时侧脑室注入LY294002 3μl。麻醉后18小时用Western blot检测cleaved caspase-3,TUNEL检测用于检测海马细胞凋亡,细胞色素C用于检测线粒体功能,Drp1,Mfn2测定线粒体动力学,免疫组化检测neuroglobin的表达,免疫荧光双染检测neuroglobin的表达分布和定位,同时用Western blot检测neuroglobin,Akt,pAkt,观察七氟烷对pAkt的影响以及hemin是否通过PI3K/Akt这一通路起作用。检测HO-1及SOD的表达,从氧化应激角度观察七氟烷的神经毒性及hemin的保护作用。Morris水迷宫实验用于检测生后30天大鼠的认知功能并用Western blot检测PSD-95及GAP-43的表达。结果:1七氟烷引起海马区细胞凋亡的增加并引起线粒体动力学平衡失调,氧化应激反应增加,吸入3%的七氟烷4小时会引起大鼠认知功能障碍。同对照组比较,七氟烷组新生SD大鼠海马内cleaved caspase-3、细胞色素c、HO-1、Drp1及neuroglobin的表达增加,Mfn2、pAkt、SOD的表达下降,象限停留时间减少(P0.05)。同S组相比,TUNEL检测SH组凋亡细胞数减少(P0.05)。SH组凋亡细胞数与C组比较无统计学差异(P0.05)。2 Hemin引起脑红蛋白的表达升高,减少了七氟烷暴露引起的海马区细胞的凋亡,改善线粒体动力学,减少氧化应激损伤,改善七氟烷暴露引起的认知障碍。同七氟烷组比较,七氟烷+hemin组的cleaved caspase-3、细胞色素c、Drp1的表达下降,Mfn2、pAkt、SOD的表达升高,象限停留时间延长(P0.05)。免疫组织化学结果显示,在给予hemin后,同C组比较,其它三组新生大鼠海马CA1区域中Ngb的光密度值增加(P0.05)。免疫荧光双染结果表明,Ngb主要定位于神经元,少部分定位于星形胶质细胞。3氯化血红素通过PI3K/Akt途径缓解了新生SD大鼠七氟烷暴露引起的凋亡。同其他三组比较,抑制剂组pAkt/Akt明显下降,有统计学差异(P0.05)。而cleaved caspase-3的表达明显增加(P0.05)。4同C组和S组比较,我们发现H组和SH组PSD-95的表达升高,差异有统计学意义(P0.05)。同C组比较,S组GAP-43表达降低,同S组比较,SH组GAP-43表达升高,差异有统计学意义(P0.05)。5抑制剂Ly294002并未对脑红蛋白的表达产生影响。结论:Hemin可以减少新生SD大鼠海马区细胞的凋亡,改善线粒体的功能失调,减轻七氟烷吸入引起的新生大鼠认知功能的损伤及生长相关蛋白43的改变。另外,Hemin通过上调血红素氧合酶HO-1的表达缓解了七氟烷吸入引起的超氧化物歧化酶SOD水平的下将,从而增强了新生SD大鼠的抗氧化防御反应,保护其免受七氟烷暴露带来的氧化应激损伤。而hemin可能通过PI3K/Akt信号通路起到保护神经细胞的作用。另外脑红蛋白的表达并未受影响,提示PI3K/Akt可能是脑红蛋白下游的信号传导途径。
【图文】：

示意图,示意图,七氟烷,腹腔注射

组织化学和末端脱氧核苷酸转移酶 dUTP 缺口末端标记（TUNEL）测定。取 36 只新生雄性大鼠并饲养到生后 30 天用于 Morris 水迷宫测试。行为学测试仅选取雄性大鼠以避免由动情周期引起的潜在的变异性。将雄性幼鼠与其母鼠一起饲养至 3 周龄然后分笼饲养至 30 天。2.2.2 分组7 日龄健康 SD 雄性鼠 84 只，体重 16-18g。随机分为 4 组：（1）对照组（C 组）：仅腹腔注射同等体积的生理盐水，并吸入 40％氧气和 60％氮气的混合气体;（2）氯化血红素给药组（H 组），在生后第 5 天和第 6 天腹腔注射 hemin（50mg·kg-1）;（3）七氟烷组（S 组）：吸入 3%的七氟烷约（1.5MAC）4 小时，吸入氧浓度 40%，氮气60%；（4）七氟烷+hemin 组生后第 5 天和第 6 天腹腔注射 hemin（50mg·kg-1）SH组中吸入 3％的七氟烷 4 小时，并在生后第 5 天和第 6 天腹腔注射 hemin（50mg·kg-1）。

示意图,实验流程,示意图

中国医科大学博士学位论文5图 2 实验流程示意图2.2.3 腹腔给药将新生鼠仰卧，用左手食指和中指夹住两上肢，用拇指和无名指夹住两下肢，，选取肚脐以下平面左侧腹腔进针，用 1ml 注射器针头以 30°角进针，针尖斜向头侧，有落空感后回抽无血液给予 hemin 腹腔注射。对照组给予同样剂量的生理盐水。2.2.4 药物制备Hemin（Sigma,美国）粉末避光保存于棕色瓶中。用天平称取 300mg hemin 并溶于 10ml0.1MNaOH 氢氧化钠溶液中，用旋涡振荡器震荡 30min，使其充分溶解。然后用 0.1M 盐酸调节 pH 值至 7.4，并用盐水稀释至所需体积 30ml[19]。分装在 1.5ml的EP管中冻存于-20℃冰箱。根据既往研究选取50mg·kg-1的剂量进行腹腔注射[20]。2.3 实验方法与组织制备2.3.1 麻醉处理在自制的 40cm×30cm×40cm 的麻醉箱中以 40%的氧气作为载体吹入 3%的七氟烷，该箱可以密闭，两侧分别有进出气体的管路，箱中有钠石灰吸收过多的二氧化碳，顶部有玻璃门方便拿取大鼠。用水浴箱维持麻醉箱内的温度在 30±1℃。使用麻醉气体监护仪监测麻醉深度在 1.5MAC。麻醉开始将七氟烷的挥发罐开到 8%，直到麻醉监护仪中的 MAC 值达到 1.5
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R726.1

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