胚胎期斑马鱼丙泊酚暴露抑制MBP蛋白表达及机制的研究

发布时间：2020-04-17 23:26

【摘要】：研究背景在我国,随着麻醉技术水平不断发展和“二胎”政策的开放,每年有成千上万名新生儿及婴幼儿甚至孕妇需接受必要的诊断性检查、手术以及镇痛治疗等,需要进行全身麻醉。既往认为,全身麻醉是一种可逆性的意识改变,而近几十年的动物实验、临床回顾性分析结果显示麻醉药物本身可能对胎儿及小儿神经发育有潜在风险,这也成为越来越多临床麻醉工作者、家长及社会广泛关注的热点问题。丙泊酚(propofol,2,6-二异丙基苯酚)作为临床上目前最常用的静脉麻醉药,具有起效快、苏醒迅速、持续输注后无蓄积、不良反应少等优点,被广泛用于各类手术的全身麻醉。有关丙泊酚对神经毒性的动物实验研究发现丙泊酚可以诱导神经细胞凋亡增多、影响突触发生和塑形障碍,甚至导致短期或长期的行为学异常。虽然神经元是神经系统中发挥主要功能的细胞,但是神经胶质细胞总共占神经细胞的50%,越是高等的动物,神经胶质细胞所占比例越高,而少突胶质细胞占全部神经胶质细胞的70%,其主要功能是在中枢神经系统中包绕轴突、形成绝缘的髓鞘结构和维持神经元的正常功能,而髓鞘是保证神经信号快速、准确、单向传导的重要结构。其中,髓鞘碱性蛋白MBP是成熟少突胶质细胞的标志性蛋白,也是髓鞘结构的重要组成成分,在成髓鞘过程中发挥重要的作用。少突胶质细胞发育成熟的过程中会受到多种信号的调节,转录因子Olig2主要参与少突胶质细胞早期的定向发育和分化,而Oligl主要在髓鞘形成的终末阶段发挥作用。此外,Olig1、Olig2还可正性调控MBP启动序列的转录。近期研究发现,新生猕猴和孕期猕猴接触丙泊酚5h,可诱发胎儿脑部神经元的凋亡增多,并在少突胶质细胞形成髓鞘的起始时期诱导少突胶质细胞的凋亡增多,另外,胎儿期相对于新生猕猴丙泊酚暴露,大脑神经细胞的受损情况更加严重。胎儿期是各类神经细胞发育的起始阶段,也是少突胶质细胞增殖分化、成熟的重要时刻,此时暴露于丙泊酚是否会对胎儿发育中大脑的少突胶质细胞成熟和髓鞘化产生不利影响,还需进一步探索。我们在前期研究中建立了胚胎期斑马鱼丙泊酚暴露模型,发现丙泊酚可导致3dpf幼鱼脑部神经细胞凋亡增多并在MBP生成初期下调其表达。本研究,将进一步观察不同发育阶段的胚胎期斑马鱼丙泊酚暴露所致行为学改变及MBP下调的作用机制。研究目的1.观察胚胎期斑马鱼丙泊酚暴露对不同发育时期幼鱼MBP表达的持续性影响2.观察胚胎期斑马鱼丙泊酚暴露对不同发育时期幼鱼行为改变3.探究胚胎期斑马鱼丙泊酚暴露对引起MBP表达下降的可能机制研究内容与方法1.实验动物与分组选用成年野生型和转基因Tg(mbp:GFP)、Tg(olig2:DsRed2)斑马鱼,雌雄各半,鱼龄6个月-1年左右,下午18:00将雌雄成鱼按1:1或1:2比例配对,次日待雌鱼产卵后将胚胎收集置于28.5℃的恒温孵箱中。6h后,用吸管吸除死卵,将剩余卵随机分组到六孔板中,每孔30卵,加入含有200μg/m、30μg/ml丙泊酚的幼鱼孵化液,同时设立空白对照组、DMSO组(0.014%),每孔5ml。24hpf时移除死卵,更换各分组一半受试液,48hpf时,所有组别更换为新鲜幼鱼孵化液。对需要拍照观察的幼鱼,需加入0.003%PTU,抑制色素保持鱼体透明。2.qRT-PCR、Western-Blot 法检测MBP和olig2的 mRNA、蛋白表达收集不同发育阶段幼鱼组织,提取RNA和蛋白,通过实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法检测MBP和olig2的mRNA、蛋白表达情况3.幼鱼行为学检测利用noldus行为跟踪系统和分析软件导出幼鱼运动参数,分析行为变化4.TUNEL检测少突胶质细胞凋亡收集不同发育阶段Tg(mbp:GFP)幼鱼,制作冰冻切片,利用TUNEL、免疫荧光双标染色检测凋亡情况5.吖啶橙检测少突胶质前体细胞凋亡用吖啶橙染料对48hpf Tg(olig2:DsRed2)转基因幼鱼活体凋亡染色,检测少突胶质前体细胞的凋亡情况6.EDU检测少突胶质前体细胞增殖使用EDU标记S期增殖细胞,制作Tg(olig2:DsRed2)转基因幼鱼冰冻切片,并进行染色,检测前体细胞增殖情况7.统计学分析使用SPSS21.0统计学软件进行统计分析,计量资料以均数±标准差(X±s)表示,One-Way ANOVA单因素方差分析。分别采用LSD(方差齐时)或Tamhane(方差不齐时),P0.05为差异有统计学意义。使用GraphPad Prism6.0作图软件和image J灰度值分析。研究结果1.3dpf、7dpf MBPmRNA表达下调(P0.05),3dpf、7dpf、10dpfMBP蛋白表达均下调(P0.05);olig2 mRNA、蛋白在48hpf表达下降(P0.05);DMSO组与对照组相比,无统计学意义(P0.05)。2.5dpf幼鱼运动活力、对环境适应能力明显减弱(P0.05),7dpf幼鱼环境适应能力、对刺激的反应速度有所减弱(P0.05),1Odpf幼鱼各项结果无统计学差异(P0.05)。3.3dpf各浓度组和7dpf较高浓度组少突胶质细胞凋亡数目显著增多(P0.05);48hpf少突胶质前体细胞凋亡数目成浓度依赖性增多(P0.05)。4.胚胎期丙泊酚暴露后少突胶质前体细胞增殖率未发生明显变化(P0.05)结论1.胚胎期斑马鱼丙泊酚暴露后可持续抑制幼鱼MBP表达至1Odpf。2.胚胎期斑马鱼丙泊酚暴露可导致5dpf、7dpf幼鱼发生行为改变。3.胚胎期斑马鱼丙泊酚暴露后幼鱼MBP表达减少可能与丙泊酚下调转录因子olig2表达,以及促进少突胶质细胞及其前体细胞的凋亡增多有关。4.胚胎期斑马鱼丙泊酚暴露不会明显抑制少突胶质前体细胞的增殖。
【图文】：

幼鱼的安全感明显增加，表现为运动兴奋。各时间点内的结果显示，５ｄｐｆ逡逑３（Ｖｇ／ｍｌ丙泊酚暴露组，，无论在黑暗还是光照周期内，幼鱼的运动活力与正常对逡逑照组相比明显降低（Ｐ＜０．邋０５）（见图１－４图Ａ），说明幼鱼对外界刺激的反应性逡逑均变弱，对强光与黑暗交替刺激下的环境表现为不适应；而７ｄｐｆ幼鱼３０ｐｇ／ｍｌ逡逑２２逡逑

结果显示，与对照组相比，ｏｌｉｇ２蛋白在４８ｈｐｆ的表达呈剂量依赖性下降（Ｐ逡逑＜０．邋０５），而７ｄｐｆ、ｌＯｄｐｆ丙泊酸暴露组ｏｌｉｇ２蛋白表达与对照组相比，无显著逡逑性差异0Ｐ＞0．邋0５）（见表２－７、图２－２）。逡逑表２－７不同组别各发育时期ｏｌｉｇ２蛋白表达比较（ｉ±ｓ）逡逑Ｔａｂｌｅ邋２－７．邋Ｔｈｅ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｏｌｉｇ２邋ａｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ邋ｓｔａｇｅｓ邋（邋ｘ土ｓ）逡逑ｇｒｏｕｐ逦ｎ逦４８ｈｐｆ逦７ｄｐｆ逦ｌＯｄｐｆ逡逑ｃｏｎｔｒｏｌ逦３逦０．９２士邋０．０４逦ｌ邋．０４邋士０．０３逦０．９６±０．０８逡逑２０＾ｌ／ｍｌ逦３逦０．５８士邋０．０４＋逦ｌ邋．０７邋士邋０．０７逦ｌ．０５邋士邋０．０６逡逑３０（ｉｌ／ｍｌ逦３逦０．２ｌ±０．０５＋＃逦ｌ．０３邋土邋０．０５逦ｌ．００邋士邋０．０３逡逑Ｏｎｅ－ｗａｙ邋ＡＮＯＶＡ邋ＬＳＤ邋多重比较方法邋＊尸邋＜０？邋０５邋ｖｓ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ；邋＃尸邋＜０？邋０５邋ｖｓ邋２０｝ｉｌ／ｍｌ逡逑ｎ代表实验重复次数，８０条鱼／组／次逡逑４４逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R614

【相似文献】

相关硕士学位论文 前1条

1 刘川;胚胎期斑马鱼丙泊酚暴露抑制MBP蛋白表达及机制的研究[D];南方医科大学;2018年

本文编号：2631430