Sec22b及Ykt6在大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用机制研究

发布时间：2020-04-26 03:06

【摘要】：第一部分Sec22b及Ykt6与脑缺血再灌注的相关性研究目的:研究大鼠脑缺血再灌注(MCAO/R)后脑组织中Sec22b及Ykt6的蛋白表达水平及其分布的变化。方法:(1)随机选取30只SD大鼠分为以下5组:假手术组、MCAO/R后6h、12h、24h、48h,每组6只大鼠。所有大鼠均在脑组织缺血再灌注后相应时间点被处死。取大鼠脑梗侧脑组织,通过Western blot分析及免疫荧光技术来检测Sec22b及Ykt6的蛋白水平及分布情况。(2)培养大鼠原代神经元细胞,随机分为以下5组:正常对照组、OGD/R后6h、12h、24h、48h。所有神经元细胞均在氧糖剥夺再灌注后相应时间点固定细胞,通过Western blot分析及免疫荧光技术来检测神经元内Sec22b及Ykt6的蛋白水平及分布情况。结果:1、大鼠脑缺血再灌注后脑组织内的Sec22b水平呈先上升后下降的变化,以MCAO/R后24h组Sec22b蛋白水平上升最为显著(P0.01);而Ykt6水平呈逐渐下降趋势,在所研究的时间点内以MCAO/R后48h组Ykt6蛋白水平下降至最低(P0.05)。2、神经元氧糖剥夺再灌注后神经元内的Sec22b水平同样呈先上升后下降的变化,以OGD/R后24h组Sec22b蛋白水平上升最为显著(P0.01);而Ykt6水平同样呈逐渐下降趋势,在所研究的时间点内以OGD/R后48h组Ykt6蛋白水平下降至最低(P0.05)。3、体内免疫荧光结果显示Sec22b在脑缺血再灌注后24h细胞内的定位明显升高;体外免疫荧光结果显示氧糖剥夺再灌注后24h神经元细胞内Sec22b主要聚集在神经元轴突的末梢。结论:MCAO/R后Sec22b的表达水平明显升高,并且主要积聚在神经元轴突的末梢;而Ykt6的表达水平呈逐渐下降趋势。第二部分Sec22b及Ykt6在脑缺血再灌注损伤中所起的作用目的:探索通过Sec22b及Ykt6质粒和小干扰RNA的干预后Sec22b及Ykt6在脑缺血再灌注后细胞内的表达和分布情况,以及其发生的变化在大鼠脑缺血再灌注损伤中所起的作用。方法:随机选取144只SD大鼠,分为以下8组:假手术组、MCAO/R组、MCAO/R+Ctr Si RNA组、MCAO/R+Si RNA-Sec22b组、MCAO/R+Si RNA-Ykt6组、MCAO/R+Vehicle组、MCAO/R+Over-Sec22b组、MCAO/R+Over-Ykt6组,每组18只。在转染Sec22b或Ykt6质粒与小干扰RNA后48h造模。在脑缺血再灌注后24h取出脑组织进行TUNEL染色和FJB染色,同时取其血液行ELISA检测;另取每组6只大鼠造模24h后取其梗死侧脑组织进行Western blot分析及免疫荧光分析。再取每组6只大鼠造模24h后取其脑组织行TTC染色。结果:1、过表达Sec22b使其在脑组织内的表达水平及分布明显上升,而小干扰RNA处理后其水平及分布显著下降。2、过表达Ykt6使其在脑组织内的表达水平明显上升,而小干扰RNA处理后其水平显著下降。3、在体内TUNEL染色、FJB染色及ELISA检测结果表明:过表达Ykt6可显著降低脑缺血再灌注后神经元细胞的凋亡、坏死及炎症反应,而过表达Sec22b后显著加重了神经元细胞的凋亡、坏死和炎症反应;抑制Ykt6的表达很大程度上可加重神经元细胞的凋亡、坏死和炎症反应,而抑制Sec22b的表达却可适当减轻神经元细胞的凋亡、坏死和炎症反应。4、根据TTC染色结果显示:过表达Ykt6和下调Sec22b能使脑梗死面积缩小,而过表达Sec22b和下调Ykt6却使脑梗死面积增大。结论:Sec22b水平的升高或Ykt6水平的下降可一定程度上加重脑缺血再灌注损伤,而Sec22b水平的下降或Ykt6水平的上升在很大程度上能减轻脑缺血再灌注损伤。第三部分Sec22b及Ykt6在氧糖剥夺再灌注后体外神经元内所起的作用及其在继发损伤细胞自噬中的作用目的:通过Sec22b及Ykt6质粒和小干扰RNA干预原代神经元后检测其OGD/R后神经元TUNEL染色、ELISA、LDH来验证Sec22b及Ykt6对氧糖剥夺再灌注损伤的作用,并通过免疫荧光检测自噬特异性蛋白LC3的定位及其与Sec22b和Ykt6的结合程度来评估其对细胞自噬的影响程度。方法:培养原代神经元细胞,将其分为以下8组:正常对照组、OGD/R组、OGD/R+Ctr Si RNA组、OGD/R+Si RNA-Sec22b组、OGD/R+Si RNA-Ykt6组、OGD/R+Vehicle组、OGD/R+Over-Sec22b组、OGD/R+Over-Ykt6组。通过TUNEL染色、ELISA、LDH来检测神经元细胞的凋亡、炎症及坏死情况,并通过免疫荧光来评估细胞自噬。结果:1、体外TUNEL染色、ELISA、LDH结果表明:过表达Ykt6或者抑制Sec22b的表达可减轻神经元细胞的凋亡、炎症及坏死情况;而过表达Sec22b或者抑制Ykt6的表达可加重神经元细胞的凋亡、炎症和坏死情况。2、当发生氧糖剥夺再灌注后自噬特异性蛋白表达上升,其与Sec22b的结合程度较正常时有所下降,而其与Ykt6的结合程度较正常时明显上升。结论:体外氧糖剥夺再灌注后所引起的损伤会因为Sec22b水平的上升或者Ykt6水平的下降而得以加重,但当Sec22b水平下降或者Ykt6水平上升,氧糖剥夺再灌注损伤会有所缓解。另一方面,当发生氧糖剥夺再灌注后细胞自噬加强,根据与自噬特异性蛋白的结合程度可以看出,Ykt6在氧糖剥夺再灌注后的自噬中其中重要作用。
【图文】：

1 第一部分实验设计图：此图分体内实验和体外实验两部分，体内实及脑缺血再灌注后不同时间组，共计 5 组，，体外实验分正常组及氧糖剥同时间组，共计 5 组，主要通过 Western blot 及免疫荧光技术来验证在损伤后 Sec22b 及 Ykt6 的表达水平变化及亚细胞分布情况。 大鼠实验性脑缺血再灌注模型的建立1）4%水合氯醛（药物效量：10ml/kg）对 SD 大鼠进行腹腔注射麻醉。2）麻醉成功后，将大鼠仰卧于操作台上，颈部去毛备皮，酒精常规消3）作右侧颈部旁切口，钝性分离肌肉，寻找颈动脉鞘，分离颈总动脉在离颈动脉约 0.8cm 处结扎颈总动脉近心端。4）分离颈外动脉和颈内动脉，结扎颈外动脉，在颈内动脉起始端放置用丝线，不收紧线结。5）用一把眼科剪轻垫于右侧颈总动脉末端的后方，用另一把眼科剪在

5 MCAO/R 后 TTC 染色后显脑缺血再灌注模型的建立：前一天包板，消毒相关手术的SD孕鼠断颈处死，酒精浸并减轻它们的痛苦。除其脑表面血管及脑膜后，PBS冲洗3次白酶消化分解脑组织，置于，加入PBS冲洗3次。悬液，过筛，收集细胞悬液500×g离心5分钟，弃去上清
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R743.3

【参考文献】

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1 Wenqi Chen;Yinyi Sun;Kangyong Liu;Xiaojiang Sun;;Autophagy: a double-edged sword for neuronal survival after cerebral ischemia[J];Neural Regeneration Research;2014年12期

本文编号：2641012