硫化氢通过增强自噬减轻肾脏缺血再灌注损伤

发布时间：2017-03-25 06:02

  本文关键词：硫化氢通过增强自噬减轻肾脏缺血再灌注损伤，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景缺血-再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)是指在缺血一段时间后恢复血流供应,组织器官会受到一定的损伤。肾脏IRI在临床中是比较常见的病理生理过程,是导致缺血性急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)的重要因素之一。在临床上很多情况下均会发生肾脏IRI,例如外科手术、创伤、麻醉意外、心肺复苏、休克、败血症和肾移植等。临床上引起急性肾损伤的重要原因之一就是肾脏IRI,因此预防和治疗肾脏IRI是临床上迫切需要解决的问题。硫化氢(hydrogen sulfide,H_2S)是在哺乳动物体内发现的继一氧化氮(nitric oxide,NO)和一氧化碳(carbon monoxide,CO)之后的第三种气体信号分子,在体内可内源性生成H_2S并广泛参与机体的生理和病理生理过程。研究显示,H_2S对脑、肝脏和肾脏等多种组织缺血、缺氧损伤具有保护作用。自噬是细胞处于饥饿、缺氧或感染时,在自噬相关基因的调控下,把细胞质内部的糖类、蛋白质等分子或受损的细胞器包裹成囊泡后与溶酶体进行融合形成自噬溶酶体,利用溶酶体内的酶降解自身受损的细胞器和大分子物质成小分子物质,为细胞修复、更新提供原料与营养、保持能量稳态的过程,是有别于凋亡的另一种细胞程序性死亡机制。研究表明H_2S在肝脏和心脏IRI过程中通过抑制自噬的发生起到保护作用。研究发现H_2S在肾脏IRI过程对肾脏起到保护作用,但是H_2S是通过抑制自噬还是促进增强自噬对肾脏起到保护作用尚不清楚。目的探讨不同浓度硫氢化钠(sodium hydrosulfide,NaHS,H_2S的供体)预处理产生的H_2S对小鼠肾脏IRI的保护作用及机制。方法1.小鼠肾脏IRI模型的建立及实验分组实验分为5组:sham组、IR组、28μmol NaHS组、56μmol NaHS组和100μmol NaHS组。在手术前20min腹腔注射给予H_2S的供体NaHS。腹腔注射1.5%戊巴比妥钠(75mg/kg体重)全身麻醉后,消毒铺巾。背部中线两侧肾区切口,用玻璃分针钝性分离肾脏周围肌肉组织和肾筋膜,用无创伤动脉夹轻轻夹闭双侧肾脏动脉血管导致肾缺血,肾脏颜色由鲜红色变为苍白色。肾脏缺血45min后轻轻松开动脉夹,肾脏立即恢复血流供给,颜色由暗红色逐渐变为鲜红色,表明肾脏再灌注成功。逐层缝合肌肉和皮层,消毒伤口。动物自由摄取食物和水。于手术后24h处死小鼠,收集血液和肾脏。2.小鼠肾功能检测采用肌氨酸氧化酶法检测小鼠血浆中血肌酐(Scr)含量;采用脲酶法检测小鼠血浆中尿素氮(Bun)含量;采用双抗体夹心ELISA法检测小鼠血浆中胱抑素(Cys-c)含量。3.小鼠肾脏组织形态学观察:小鼠肾脏组织用4%多聚甲醛固定后包埋,制成石蜡切片,HE染色后观察肾脏组织结构变化;小鼠肾脏组织用2.5%的戊二醛固定后用环氧树脂包埋,醋酸双氧铀和枸橼酸铅双重染色后电镜观察超微结构。4.小鼠肾脏组织抗氧化物检测采用WST-1法检测小鼠肾脏组织总超氧化物歧化酶(SOD)活力;采用TBA法测定小鼠肾脏组织丙二醛(MDA)含量。5.小鼠肾脏组织抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax表达情况检测采用Western-blot方法检测分析小鼠肾脏组织Bcl-2和Bax蛋白表达情况。6.小鼠肾脏组织LC3,Beclin-1和P62的表达情况检测采用Western-blot方法检测分析小鼠肾脏组织Beclin-1和LC3蛋白表达情况;采用免疫组织化学方法检测小鼠肾脏组织P62蛋白的表达情况。结果1.H_2S预处理后可以明显改善由于肾脏IRI导致的肾功能改变:与sham相比较,IR组小鼠血浆中Scr,Bun和Cys-C显著升高(P0.01);与IR组相比较,28μmol NaHS组小鼠血浆中Scr和Bun下降不明显(P0.05),Cys-C明显降低(P0.05);56μmol NaHS组和100μmol NaHS组小鼠血浆中Scr,Bun和Cys-C明显降低(P0.05)。2.H_2S预处理后可以明显改善由于肾脏IRI导致的肾脏结构病变情况:与sham相比较,IR组小鼠病变明显,HE染色显示肾脏皮质和髓质交界处肾小管细胞坏死脱落;电镜下观察超微结构显示,IR组小鼠肾脏内线粒体脊和膜有融合有消失,核质有肿胀,内质网有扩张,有脱颗粒,核周隙扩张,病变严重。与IR组相比较,28μmol NaHS组、56μmol NaHS组和100μmol NaHS组小鼠肾脏病变明显得到改善。3.H_2S预处理后可以明显提高肾脏对氧自由基的清除能力,提高组织内总抗氧化能力:与sham相比较,IR组小鼠肾脏中SOD活力明显降低(P0.05),MDA含量显著升高(P0.01);与IR组相比较,28μmol NaHS组、56μmol NaHS组和100μmol NaHS小鼠肾脏中SOD活力明显升高(P0.05),MDA含量显著降低(P0.05)。4.H_2S预处理后可以明显改善肾脏的细胞凋亡情况:与sham相比较,IR组小鼠肾脏中Bcl-2蛋白表达量下降(P0.01),Bax和Caspase 3蛋白表达量升高(P0.01);与IR组相比较,28μmol NaHS组小鼠肾脏中Bcl-2蛋白表达量升高(P0.05),Bax蛋白表达量下降(P0.05),Caspase 3蛋白表达下降不明显(P0.05);56μmol NaHS组和100μmol NaHS组小鼠肾脏中Bcl-2蛋白表达量升高(P0.05),Bax和Caspase 3蛋白表达量下降(P0.05)。5.H_2S预处理后可以明显提高肾脏的自噬水平:与sham相比较,IR组小鼠肾脏组织中P62蛋白表达量显著升高,LC-3Ⅱ/Ⅰ和Beclin1蛋白表达量明显升高(P0.05);与IR组相比较,28μmol NaHS组小鼠肾脏组织中LC-3Ⅱ/Ⅰ和Beclin1蛋白表达量升高不明显(P0.05);56μmol NaHS组小鼠肾脏组织中LC-3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达量升高不明显(P0.05),Beclin1蛋白表达量明显升高(P0.05);100μmol NaHS组小鼠肾脏组织中LC-3Ⅱ/Ⅰ和Beclin1蛋白表达量明显升高(P0.05);28μmol NaHS组、56μmol NaHS组和100μmol NaHS组小鼠肾脏组织中P62蛋白表达量下降。结论1.H_2S对肾脏IRI的保护作用可能部分是通过提高肾脏抗氧化和抗凋亡能力来发挥的。2.H_2S预处理后可能通过增强自噬减轻肾脏IRI。3.56μmol NaHS和100μmol NaHS预处理对肾脏IRI的保护作用比较明显。
【关键词】：缺血再灌注 急性肾损伤 硫化氢 抗氧化 抗凋亡 自噬
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R692
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-10
• 英文缩略词表10-14
• 前言14-18
• 1 材料与方法18-30
• 1.1 实验动物18
• 1.1.1 动物饲料和动物造模试剂18
• 1.2 实验试剂18-22
• 1.2.1 蛋白检测所用试剂盒18
• 1.2.2 血液生化分析试剂盒18-19
• 1.2.3 酶联免疫吸附试验试剂盒（ELISA KIT）19
• 1.2.4 氧化抗氧化检测试剂盒19-20
• 1.2.5 病理组织切片所用试剂20-21
• 1.2.6 TUNEL细胞凋亡检测试剂盒21
• 1.2.7 Western blot试剂和耗材21
• 1.2.8 一抗和二抗21-22
• 1.2.9 免疫组化试剂和耗材22
• 1.3 主要仪器及设备22-23
• 1.4 主要试剂配制23-30
• 1.4.1 不同浓度NaHS溶液的配制23
• 1.4.2 HE染色液体23-24
• 1.4.3 灌流液和固定液24
• 1.4.4 Western Blot试剂24-28
• 1.4.5 免疫组化试剂28-30
• 2 实验方法与步骤30-48
• 2.1 小鼠肾脏IRI模型的建立及实验分组30-32
• 2.2 小鼠血液和肾脏样本的收集与处理32
• 2.3 小鼠肾功能指标检测32-34
• 2.3.1 肌氨酸氧化酶法检测小鼠血肌酐（Scr）水平32-33
• 2.3.2 脲酶法检测小鼠血液中尿素氮（BUN）水平33
• 2.3.3 ELISA法测定小鼠血液中胱抑素C（Cys-C）水平33-34
• 2.4 小鼠肾脏组织形态学观察34-36
• 2.4.1 石蜡组织切片HE染色制作34-35
• 2.4.2 电镜图片的制作35-36
• 2.5 小鼠肾脏抗氧化能力检测36-39
• 2.5.1 采用WST-1 法检测小鼠肾脏组织总超氧化物歧化酶（SOD）活力36-38
• 2.5.2 采用TBA法测定小鼠肾脏组织丙二醛（MDA）含量38-39
• 2.6 小鼠肾脏组织抗凋亡水平检测39-42
• 2.6.1 Western Blot法检测鼠肾脏组织凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2 和Caspase-3 的表达水平39-42
• 2.6.2 一步法TUNEL检测小鼠肾脏细胞凋亡情况42
• 2.7 小鼠肾脏组织自噬相关蛋白表达水平检测42-46
• 2.7.1 Western Blot法检测鼠肾脏组织自噬相关蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ和Beclin 1 的表达水平42-45
• 2.7.2 免疫组化法检测鼠肾脏组织自噬相关蛋白P62的表达水平45-46
• 2.8 统计学处理46-48
• 3 实验结果48-58
• 3.1 H_2S预处理可以明显改善由于肾脏IRI导致的肾功能改变48-49
• 3.2 H_2S预处理后可以明显改善由于肾脏IRI导致的肾脏病变情况49-51
• 3.3 H_2S预处理后可以明显提高肾脏对氧自由基的清除能力，，提高组织内总抗氧化能力51-52
• 3.4 H_2S预处理后可以明显改善肾脏的细胞凋亡情况52-53
• 3.5 H_2S预处理后可以明显提高肾脏的自噬水平53-58
• 3.5.1 H_2S预处理后可以明显改善肾脏组织受损的超微结构53-55
• 3.5.2 H_2S预处理后可以明显提高肾脏组织自噬相关蛋白LC-3和Beclin-1的表达55-56
• 3.5.3 H_2S预处理后可以明显降低肾脏组织自噬相关蛋白P62的表达56-58
• 4 讨论58-64
• 5 结论64-66
• 参考文献66-72
• 致谢72-74
• 硕士期间发表的学术论文74-75

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 ;中国生理学会肾脏生理专业委员会第二届学术年会日程安排及征文通知(第一轮)[J];生理科学进展;2013年02期

2 ;认识肾脏[J];人人健康;2013年03期

3 肖兵民;血管紧张素Ⅱ受体在肾脏中的分布与功能[J];医学综述;2001年04期

4 劳方元,刘卫民;瘦素与肾脏[J];医师进修杂志;2004年17期

5 孙颖浩;高旭;;肾脏下盏结石及其处理[J];医学研究通讯;2004年05期

6 耿文学,宫泽辉;血管紧张素Ⅱ受体2对心血管肾脏系统功能的影响[J];国外医学.药学分册;2005年03期

7 郭骏,程川,郑立泉;自发性肾脏破裂的诊断与治疗(附4例报告并文献复习)[J];泰山医学院学报;2005年04期

8 陈新石;;首个“世界肾脏日”新闻发布会在北京举行[J];中华医学杂志;2006年12期

9 贾俊亚;丁国华;;肾脏中肾素-血管紧张素系统的生理和病理生理作用[J];生理科学进展;2008年01期

10 李古强;高宏伟;王召友;;适宜运动对老年人肾脏的影响[J];临床合理用药杂志;2009年14期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 王辉;徐玉莲;;有氧及无氧训练对肾脏功能的影响[A];第十届全军检验医学学术会议论文汇编[C];2005年

2 殷胜勇;葛霁光;郭淼;;灌流肾脏的生理功能动态变化[A];中国生物医学工程学会第六次会员代表大会暨学术会议论文摘要汇编[C];2004年

3 殷胜勇;葛霁光;郭淼;;肾脏长期灌流损伤功能的内在机理研究[A];中国生物医学工程学会第六次会员代表大会暨学术会议论文摘要汇编[C];2004年

4 李庆文;汪盛;张青川;方习武;周文生;刘建民;;腹腔镜辅助小切口技术切除无功能炎症性肾脏[A];华东六省一市泌尿外科学术年会暨2011年浙江省泌尿外科、男科学学术年会论文汇编[C];2011年

5 常波;衣雪洁;张锦红;于媚娟;;急性运动对大鼠肾脏线粒体钙运输的影响[A];2002年第9届全国运动医学学术会议论文摘要汇编[C];2002年

6 邢宝丽;;老年患者的合理用药[A];第七届全国老年医学进展学术会议论文集[C];2007年

7 于泓;;肾脏临床-病理讨论[A];贵州省医学会肾脏病学分会2008年学术年会论文汇编[C];2008年

8 陈以平;;肾脏间质病变治疗经验[A];第七届全国中西医结合肾脏病会议专题讲座汇编[C];2003年

9 季健;马超龙;;乌司他丁对缺血再灌注损伤大鼠肾脏ICAM-1表达的影响[A];第十五届全国泌尿外科学术会议论文集[C];2008年

10 宫念樵;陈知水;明长生;张伟杰;周平;陈刚;林正斌;曾凡军;卢峡;施辉波;陈松;蒋继贫;;应用Lifeport机械灌注冷保存肾脏供体的经验[A];2013中国器官移植大会论文汇编[C];2013年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 慈照;你的肾脏疲倦了吗？[N];医药养生保健报;2006年

2 张鸿;中老年人肾脏检查一年一次[N];医药养生保健报;2007年

3 项燕;保护肾脏从饮食做起[N];医药养生保健报;2007年

4 和煦;如何关爱自己的肾脏[N];上海科技报;2008年

5 徐晓羽　本报记者 张晓祺;保护肾脏从点滴做起[N];解放军报;2009年

6 ;老年人保护肾脏五要点[N];人民政协报;2001年

7 韩绍安;肾脏在呼救 你注意到了吗[N];卫生与生活报;2007年

8 谭合钦;关爱您的肾脏[N];中国中医药报;2007年

9 ;人到老年肾脏有何改变[N];医药养生保健报;2008年

10 许陵东 江苏省中医院肾内科;善待你的肾脏[N];中国中医药报;2009年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 梁亮;何学红教授学术思想总结及肾衰方治疗慢性肾脏病的临床与实验研究[D];辽宁中医药大学;2015年

2 韦荣飞;泛素连接酶NEDL2的生理功能及分子机制研究[D];清华大学;2015年

3 李典耕;青—老年大鼠肾脏交互移植模型的构建及机体内环境衰老关键因子的研究[D];中国人民解放军医学院;2016年

4 陈福坤;犬肾脏损害对房颤凝血及内皮功能的影响[D];中国人民解放军医学院;2016年

5 贾露露;利用蛋白质组学研究肾脏蛋白处理功能[D];北京协和医学院;2011年

6 丁瑞;青年和老年大鼠肾脏互相移植引起的内环境改变对肾脏衰老的影响[D];中国人民解放军军医进修学院;2008年

7 梁卓;肾脏损害和房颤发生的相关性和机制研究[D];中国人民解放军医学院;2015年

8 石莹;尾加压素Ⅱ在自发性高血压大鼠心血管系统和肾脏的表达及对其肾脏功能的影响[D];复旦大学;2007年

9 蓝荣培;金属硫蛋白保护肾脏缺血/再灌注损伤及对免疫系统的影响[D];复旦大学;2004年

10 唐铁龙;缺血后适应对大鼠肾脏热缺血再灌注早期损伤的保护作用及其机制研究[D];四川大学;2006年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 梁慧;大鼠肾脏缺血再灌注损伤过程中水通道蛋白-2的表达变化[D];河北医科大学;2015年

2 李艳婷;CKD患者AASI及Sym-AASI与肾脏动脉阻力指数的相关性研究[D];昆明医科大学;2015年

3 宋波;低分子肝素及尿激酶改善DCD肾脏对长时间热缺血耐受的实验研究[D];第三军医大学;2015年

4 宋菲;炎症小体在衰老肾脏中的表达变化研究[D];中国人民解放军医学院;2015年

5 徐春艳;AT_1受体自身抗体促肾脏内质网应激致足细胞凋亡机制研究[D];南方医科大学;2015年

6 张思梦;膳食钙对饮水型氟暴露致子代肾脏线粒体损伤的影响[D];浙江师范大学;2015年

7 焦瑾;H型高血压患者同型半胱氨酸对肾脏功能的影响[D];新疆医科大学;2015年

8 姚丹丹;他克莫司对2型糖尿病大鼠肾脏TRPC6表达的影响[D];青岛大学;2015年

9 卢鹏;复方灵芝健肾汤对糖尿病肾病大鼠肾脏AGT和IGF-1表达的影响[D];济南大学;2015年

10 李雷兵;温阳消饮法对胸腔积液大鼠肾脏AQP2及cAMP-PKA/PKC信号通路表达的影响[D];成都中医药大学;2015年

  本文关键词：硫化氢通过增强自噬减轻肾脏缺血再灌注损伤，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：266736