激光共聚焦内镜结合荧光标记的脂肪酸特异检测大肠癌

发布时间：2017-03-30 03:16

  本文关键词：激光共聚焦内镜结合荧光标记的脂肪酸特异检测大肠癌，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景代谢是生物体内发生的用于维持细胞生长、增殖和分化等生命活动的反应进程。多数肿瘤的代谢与正常细胞存在很大差异,正常细胞依赖葡萄糖有氧氧化、脂肪酸β氧化供能,而在肿瘤中,即使氧气供给充足,肿瘤细胞很少进行葡萄糖有氧氧化过程,反之,其对外界葡萄糖的吸收大大增加且产生大量乳酸,这种以糖酵解为主的代谢方式也称为"Warburg效应”。在肿瘤细胞中,糖酵解代谢的产物丙酮酸并非进入三羧酸循环氧化,而主要参与合成代谢包括脂肪酸、核酸、蛋白质等合成。脂肪酸是机体许多器官的重要能量来源,可由食物供给和内源性的合成产生,脂肪酸合成(FASN)增加被称为肿瘤代谢的另一重要标志,其与糖酵解过程密切相关。肿瘤细胞的脂肪酸代谢途径异常,正常情况下,细胞吸收外源性的脂肪酸并将其转化为甘油三酯,以提供机体的能量储备。然而,在肿瘤细胞中,即便外源性脂肪酸供给充足,肿瘤细胞极少利用其进行甘油三酯的储备,而主要依靠糖酵解产物丙酮酸进行内源性的脂肪酸合成,肿瘤中的酯化脂肪酸均由内源性脂肪酸合成途径产生,超过93%的甘油三酯由此途径合成。这种正常和肿瘤细胞中脂肪酸的代谢差异揭示了两者在外源性脂肪酸吸收及内部脂肪酸利用的差异。结肠癌是发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤,在全球女性癌症相关死亡率中位居第三,男性中位居第四,2008年全球因结肠癌死亡人数为608,700,过去认为主要由基因突变所致,近年来,随着环境改变和人们不均衡的膳食模式等原因,其发病率不断增长,已成为我国发病率升高最快的恶性肿瘤之一。肿瘤治疗的关键在于早期发现,如果能在肿瘤发展早期作出相应的判断和检测,50%以上的恶性肿瘤可以治愈,5年生存率可达80-90%。结肠癌早期因其组织的结构和功能未出现明显变化,诊断仅依赖临床医师的经验和肿瘤宏观形态学、血清肿瘤标志物、影像学、病理学等手段,敏感度和特异度较低。内镜被认为是结肠癌早期诊断最有效的方式。普通内镜对早期胃肠癌的诊断率低,新兴的内镜如染色内镜、放大内镜、超声内镜等明显提高了早期胃肠道肿瘤的检出率。染色内镜能对黏膜细微结构进行观察,可根据黏膜及黏膜下血管纹理判断病变的性质,对于扁平病变有较好的诊断,目前已运用到全消化道黏膜表层的检查。放大内镜通过在病变表面喷洒0.3%Lugol碘液或0.4%靛胭脂染色后对组织局部放大10-100倍,较清晰的显示腺管开口形态,可在行内镜检查的同时判断病变是否行内镜黏膜切除术(EMR),对早癌的诊断优势明显。超声内镜将内镜和超声波结合于一体,行内镜检查同时,使用超声对待观察部位进行定点探测,可知病变侵润的深度、血管累及情况及与周围脏器的关系。其在胰腺癌的诊断、胰腺假性囊肿穿刺治疗方面有着其他内镜不可比拟的优势。激光共聚焦内镜(CLE)是一种新型的内镜技术,它是传统电子内镜和激光共聚焦显微镜整合的产物,在内镜检查同时,还能进行共聚焦显微镜检查,通过放大扫描检查的组织1000倍,对细胞和亚细胞结构进行观察,被称为“光学显微镜”。共聚焦内镜成像主要依靠荧光对比剂的存在,运用较多的为荧光素钠和盐酸吖啶黄,荧光素钠是一种廉价、无致突变性的对比剂,静脉注射荧光素钠数十秒后,共聚焦内镜下即可清晰显示细胞轮廓和排列方式,其成像范围可从上皮表面深入至固有层,然而荧光素钠并不富集于细胞核,不易观察到细胞核形态,对病变的良恶性判别构成很大干扰,且其可引起不良反应如过敏反应、恶心、呕吐、眩晕等。盐酸吖啶黄是通过局部喷洒对胃肠道黏膜进行染色,其可以穿过细胞膜与细胞核的酸性物质结合,因此可以清晰显示细胞核,但其成像范围局限于粘膜表面,不能行粘膜层以下的对比检查,且尤为重要的是盐酸吖啶黄有轻微的致突变作用,临床上应谨慎使用。基于共聚焦内镜巨大的使用价值,国内外研究报道了许多新型的荧光对比剂,如荧光标记抗体(CD31、 VEGF、EGFR)、荧光标记的缩氨酸、代谢相关的荧光探针等。荧光基团标记的脂肪酸BODIPY-FA(C22H31BF2N2O2)是天然脂肪酸的类似物,其分子量为404,具有亲脂性,激发/发射波长为500/510nm能被488nm的氩离子激光器激活,目前主要运用在脂肪酸转运的研究中,可于流式细胞仪及共聚焦显微镜下观察。研究目的在共聚焦内镜下,于不同肠癌模型的小鼠肠道局部给予BODIPY-FA染色,分析不同病变性质的组织对BODIPY-FA的吸收情况,比较不同染色剂对于肿瘤诊断的效能,同时探讨肠癌中脂肪酸吸收减少的相关机制。研究方法1、流式细胞仪检钡BODIPY-FA在肠癌细胞株中的吸收曲线及其与硬脂酸的吸竞争抑制作用(1)将不同的结肠癌细胞株以相同密度600,000个/孔培养于六孔板中,分别加入1ml的luM BODIPY-FA工作液,恒温箱内放置10秒,30秒,1分钟,2分钟,5分钟,10分钟6个时间点,吸去BODIPY-FA,0度冰PBS终止反应并清洗,经消化、离心后,流式细胞仪检测各时间点不同细胞对BODIPY-FA的荧光吸收值。(2)将不同的结肠癌细胞株以相同密度600,000个/孔培养于六孔板中,用luM的BODIPY-FA工作液和浓度分别为0.15uM、1.5uM的硬脂酸混合液等体积混合,分别加入1ml上述不同混合液,无硬脂酸的为对照组,恒温箱中放置10分钟,0度冰PBS终止反应并清洗,经消化、离心后,流式细胞仪检测各实验组BODIPY-FA的荧光吸收值。2、构建动物模型(1) AOM/DSS化学诱导结肠癌模型选取年龄为6周的Balb/c雄鼠,腹腔注射AOM12.5mg/kg后,正常饮水7天,于第2周予3%DSS连续7天,然后正常饮水连续14天,此为一个循环,即连续给予3%DSS 7天,而后休息14天,总共三个循环。最后一个循环结束建模完成,不再给予DSS,我们前期的实验结果发现：癌变的肠段(多靠近直肠)可出现肉眼可见的肠壁增厚、僵硬,能较好的提示肿瘤所在位置并进行染色处理。分批次提取老鼠,可直接处死小鼠进行组织染色的观察和切片,也可进行后续的活体实验。(2) APCmin小、鼠年龄为6-7周的APC-min雄鼠购自南京大学模式动物中心,为自发的肠道腺瘤模型,购买6-8周雌鼠与之交配,待繁殖数量较多的小鼠并DNA鉴定后,可直接处死小鼠进行组织染色的观察和切片,也可进行后续的活体实验。(3)裸鼠肠道移植瘤模型选取年龄为6周的Balb/c裸鼠。取处于对数期生长期的肠癌细胞株LOVO大批量传代,经消化、计数、离心后,弃上清收集细胞沉淀。在严格无菌条件下,以外科手术方式,用29g的微型注射器将细胞沉淀(每次细胞个数约106)注射入结肠浆膜层,注射成功的浆膜层可见局部圆形白色的隆起,有时可沿管壁呈纵形。关闭腹腔,表面消毒。约3-4周后移植的LOVO可突破肌层到达粘膜下层甚至粘膜层。3、动物实验(实验过程避光进行)(1)将肠癌模型的小鼠禁食12小时,以保证肠道清洁,用戊巴比妥0.01g/ml,剂量为6-7ul/g小鼠体重,腹腔注射麻醉,采用外科手术方式暴露腹腔,间断分离2段长约1cm的结肠,以手术缝线结扎肠段两端,结扎程度松紧适宜,以荧光染料不能通过结扎口,又不影响肠管血运为佳。用注射器吸取100u1的染色剂注射入结扎好的肠段内,小鼠分3组,染色剂分别为200uMBODIPY-FA、0.02%吖啶黄、500uM 2-NBDG。10分钟后拆除缝线并冲洗,可将染色部分的肠管剪取行快速冰冻切片,也可运用共聚焦内镜在体观察。(2)将共聚焦内镜的激光能量和亮度固定,于上述小鼠荧光剂局部染色10分钟后,将染色部位冲洗干净,共聚焦内镜探头与肠粘膜层紧密接触,每个部位观察时间不超过20秒。内镜医师根据共聚焦成像判断探测部位的性质,实验者用29g注射器(吸取印度墨汁)准确标记经内镜医师判断过的病变部位。标号后的组织冰冻切片,HE金标准结果和共聚焦内镜诊断一一对应。4、组织化学法将小鼠活体染色后的组织包埋、速冻后,快速冰冻切片,厚度为5um,轮流贴片(一半用于HE染色,一半用于荧光染色),置于室温避光干燥10-20分钟。HE染色的切片经苏木素染色、分化、返蓝、伊红染色、梯度脱水后,中性树胶封片。荧光染色的切片在组织上滴染核染料DAPI,8-10分钟后室温干燥,抗荧光淬灭封片剂封片,于荧光显微镜下观察、拍片。5、荧光定量PCR提取组织的RNA并检测浓度,用TaKaRa逆转录试剂盒两步法完成cDNA合成,第一步：反转录反应37℃ 15min；第二步：反转录酶失活85℃ 5s。使用TaKaRa SYBR Premix Ex Taq试剂盒和LC480 System荧光定量PCR扩增仪进行荧光定量PCR检测。6、Western blotting提取细胞蛋白,用BCA蛋白质定量试剂盒检测样品的蛋白浓度。经电泳、蛋白质电转至PVDF膜,5%脱脂牛奶封闭,一抗孵育4℃过夜,一抗稀释比例分别为CD36(1:400)、Caveolin-1(1:500)、GAPDH(1:3000),而后二抗(1：2500)孵育1小时,ECL化学发光法显影。7、免疫组织化学收集南方医院25例结直肠癌手术患者配对标本(正常和肿瘤共50),组织经常规固定、包埋、切片、脱蜡、水化后,以0.01M枸橼酸钠缓冲液(pH6.0)95度高温抗原修复10分钟,使用超敏SP试剂盒阻断、封闭,一抗稀释浓度为Caveolin-11:100、CD36 1:100,一抗孵育4℃冰箱过夜,然后DAB显色剂显色,苏木素复染、返蓝,常规脱水、透明及封片后,于显微镜下观察。8、分析及统计方法荧光显微镜下组织的平均荧光强度使用Image-Pro Plus 6.0统计软件,共聚焦图片的灰度值使用Image J软件,共聚焦图片选取分析面积为60x60um,同一病变性质的区域选取3个取其平均值,所有数值为平均值士标准误。实验数据采用GraphPad Prism (v5.00)统计软件,两组间比较用两独立样本t检验,多组组间比较用单因素方差分析。P值0.05具有统计学差异。结果1、BODIPY-FA在肠癌细胞内的吸收及与硬脂酸竞争情况不同细胞株对BODIPY-FA的吸收存在差异,SW480对BODIPY-FA的吸收量最多,而LOVO和HCT116对其吸收相对较少。在10分钟内,SW480、 LOVO、HCT116细胞吸收BODIPY-FA呈不断增长曲线提示其在细胞内不断蓄积,而HT29在10分钟可见下降趋势。此实验探索了贴壁细胞对BODIPY-FA染色的最佳时间,为后续的动物在体染色实验提供参照。在BODIPY-FA与硬脂酸(C18：0)的吸收竞争实验中,浓度为0.15uM和1.5uM的硬脂酸能不同程度的抑制细胞对BODIPY-FA的吸收,这种抑制效应在SW480中最为显著。实验证明BODIPY-FA与硬脂酸共同竞争细胞膜上的脂肪酸转运蛋白,其为脂肪酸的类似物,可作为游离脂肪酸的替代物进行生物体内代谢情况的研究。2、Caveolin-1和CD36在人结肠癌组织中表达降低荧光定量PCR检测配对的人结肠癌患者正常和肿瘤组织中mR NA的表达。CD36mRNA在肿瘤组织中表达量显著低于正常黏膜,(肿瘤：0.003643±0.0006902,正常：0.07623±0.01995,P0.005)。caveolin-1 mRNA在肠癌组织中表达量较正常组织降低(肿瘤：0.1031±0.04203,正常：0.4381±0.1129,P0.005)。余FABPpm、FATP4mRNA在肿瘤和正常组织中表达无明显差异。通过Western blotting检测配对标本中Caveolin-1和CD36的蛋白表达量。86%的肿瘤组织Caveolin-1蛋白低表达,其平均表达量较正常组织减少约1.6倍。CD36在肿瘤组织中表达明显减少,约为正常黏膜的1/2甚至1/4。免疫组化检测人结肠癌配对标本中Caveolin-1和CD36的蛋白表达情况,结果示：Caveolin-1主要于胞膜和胞浆中表达,在血管和基质细胞内也可检测到表达,Caveolin-1于肿瘤中的表达较正常组织明显降低,P=0.0024。CD36蛋白主要表达在细胞膜,在胞浆、胞核中也有少量表达,相对于正常黏膜,CD36在肠癌的粘膜细胞极少观察到染色阳性的细胞,表达显著减少,P0.0001。3、荧光显微镜下BODIPY-FA在小鼠结肠癌模型中成像运用自体对照的方法,于小鼠肠段局部BODIPY-FA染色,组织冰冻切片后荧光显微镜成像显示：在AOM/DSS诱导肠癌的小鼠中,87.1%的肿瘤部位显示为荧光低信号,相比正常粘膜显著降低,(肿瘤：0.0836士0.0057,正常：0.1281士0.0106,P=0.0005)：同时BODIPY-FA在炎症部位的荧光信号强于正常粘膜(炎症：0.145士0.0212,P=0.4639),有助于判别肿瘤/炎症/正常组织。在APC-min小鼠中,100%的腺瘤为BODIPY-FA低信号,正常黏膜对其吸收明显增加,(肿瘤：0.0648士0.018,正常：0.15士0.0178,P=0.0092)。BODIPY-FA染色后成像效果清晰,荧光显微镜下除能清晰显示常规的腺体结构、细胞排列外,也可对细微结构进行描述,如同另一种形式的免疫组化特异、直观的展现观察部位的病变情况。2-NBDG局部喷染不同小鼠模型的肠道,组织切片荧光显微镜成像示：荧光强度弱、细胞轮廓不清晰,正常粘膜和肿瘤部位的2-NBDG荧光信号无差异。盐酸吖啶黄染色后,使黏膜表层粘膜上皮细胞、血管内皮细胞、炎症细胞等胞核均着色,少量能进入细胞质,肿瘤和正常部位的荧光值无差异。4、激光共聚焦内镜下BODIPY-FA在小鼠结肠癌模型中成像肿瘤组织在共聚焦内镜下的成像显示为相对性“暗区”,在AOM/DSS化学诱导肠癌的小鼠中,85%的肿瘤部位荧光信号低于正常黏膜,平均灰度值明显降低,(肿瘤：66.27±3.387,正常：121.8±8.281,P0.0001),同时炎症组织对BODIPY-FA吸收较正常黏膜增多(炎症：133.4±11.13,P=0.4077)。在APC-min中,100%的腺瘤对BODIPY-FA吸收减少,平均灰度值显著低于正常部位,(肿瘤：56.23±4.03,正常：148.8±10.85,P0.0001)。同时因共聚焦内镜本身设备的优势,BODIPY-FA染色后可清晰显示细胞的排列、轮廓、核/质比例及反衬下的胞核形态。将共聚焦内镜与BODIPY-FA染色结合,通过肿瘤呈现的特异性低信号及细胞、亚细胞水平的成像便于对组织性质的判定。同时BODIPY-FA的吸收为主动转运过程,仅具有生物学活性的组织才能较好的显示其分布,死亡小鼠或断离时间较长的组织成像效果差。共聚焦内镜结合2-NBDG局部染色显像模糊,荧光信号弱,短时间内极少进入细胞内,不能对观察部位的病变类型作出判断。使用盐酸吖啶黄染色的部位,所有组织的胞核均能显示,不同病变类型无差异。结论通过上述实验结果,我们得出以下结论：1、BODIPY-FA为脂肪酸的类似物,在短时间内可于细胞内不断蓄积。2、相比其他对比剂,BODIPY-FA通过相对“暗区”特异地显示肿瘤位置,具有高特异性。3、BODIPY-FA染色后能够对所病变进行细胞、亚细胞水平的描述,成像清晰,辨析度高。4、在活体共聚焦使用中仅需局部染色,无毒性反应,方法快速、安全、便捷。5、人结肠癌组织中Caveolin-1和CD36的mRNA和蛋白表达显著降低,肿瘤对BODIPY-FA的吸收减少可能基于此原因。我们通过构建小鼠肠癌模型并在体实验发现,肿瘤组织对于BODIPY-FA的吸收明显减少,其分子机制可能与Caveolin-1和CD36低表达相关,同时BODIPY-FA与共聚焦内镜的结合实现了肿瘤特异示踪及细胞内成像,有助于病变的实时定位、定性。本研究为临床实践及科研工作提供了发现早期肿瘤的新思路,具有重要的价值。
【关键词】：结肠癌 激光共聚焦内镜 脂肪酸代谢 BODIPY-FA
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.34
【目录】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-24
• 第一章 前言24-30
• 第二章 材料和方法30-44
• 1. 实验材料和试剂30-33
• 2. 实验仪器33
• 3. 实验方法33-44
• 第三章 结果44-57
• 1. BODIPY-FA在肠癌细胞株的吸收曲线及其生物学性状44-45
• 2. Caveolin-1和CD36在人结肠癌组织中表达降低45-47
• 3. 荧光显微镜下BODIPY-FA在小鼠结肠癌模型中成像47-52
• 4. 激光共聚焦内镜下BODIPY-FA在小鼠结肠癌模型中成像52-57
• 第四章 讨论57-63
• 参考文献63-70
• 中英文缩略词对照表70-71
• 攻读学位期间成果71-72
• 致谢72-74

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 ;Dysregulated lipid metabolism in cancer[J];World Journal of Biological Chemistry;2012年08期

  本文关键词：激光共聚焦内镜结合荧光标记的脂肪酸特异检测大肠癌，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：276103