人脐带间充质干细胞对急性肺损伤模型中的治疗作用与机制初探

发布时间：2020-07-30 13:40

【摘要】：第一部分人脐带间充质干细胞的分离、培养、鉴定 目的：建立稳定、高效的体外分离培养人脐带间充质干细胞（HUC-MSCs）的方法，为采用HUC-MSCs治疗急性肺损伤模型做前期准备。 方法：贴壁培养法培养HUC-MSCs。手术台取正常足月健康婴儿脐带组织，剪去两端结扎丝线，无菌条件下D-Hanks缓冲液洗涤残留血液，剖开脐带，去除静脉、动脉、外膜，并将其剪碎至1mm×1mm大小组织块，均匀接种于75cm2培养瓶中，加入完全培养基5ml，倒置于细胞培养箱内4h后翻转培养培养瓶，24h后添加培养基至12ml。每3d半量换液一次，去除未贴壁组织块。待细胞80%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化，按照2：1比例进行细胞传代培养。利用流式细胞仪检测P3代细胞表面标记物CD34、CD45、HLA-DR、CD73、CD90及CD105表达。同时利用成骨、成脂及成软骨条件培养诱导分化第3代细胞，在7天后分别观测细胞的成骨、成脂及成软骨分化能力。成骨诱导第20d后，茜素红染色鉴定HUC-MSCs成骨分化潜能。成脂诱导15d后，油红O染色鉴定HUC-MSCs成脂分化能力，成软骨组织形成后进行阿新蓝染色鉴定成软骨分化能力。 结果：原代培养的细胞约24h内贴壁生长，培养96h后在倒置显微镜下观察可见脐带组织碎块周围出现三角形和成纤维样贴壁细胞，培养12d后，细胞融合度达到80-90%，细胞呈成纤维细胞样漩涡式生长，经过连续传代10次，细胞变为形态更为均一的成纤维样，细胞形态无明显改变、无衰老。流式细胞仪检测HUC-MSCs细胞表面抗原CD34，CD45，CD73，CD90，CD105，HLA-DR表达率分别是0.19，0.19，99.96，99.10，99.42，0.10,符合HUC-MSCs细胞表面标志物特点。成骨诱导：诱导第10d可观察到细胞上方有悬浮的白色钙结节，第20d茜素红染色可见白色钙结节呈铁锈红染色。成脂诱导：诱导第5d观察到细胞胞质中开始有脂滴形成，第15d油红O染色可见脂滴红染。成软骨诱导：细胞团块在25d左右会变得致密，阿新蓝染色后成深蓝色。 结论：采用贴壁培养法分离、培养人脐带间充质干细胞的方法稳定、可靠，可以获得纯度较高具有多向分化能力的HUC-MSCs。 第二部分急性肺损伤模型的建立以及人脐带间充质干细胞对其治疗作用 目的：建立脂多糖（LPS）诱导的急性肺损伤（ALI）模型，观察HUC-MSCs对ALI模型临床指标的影响，研究HUC-MSCs对ALI模型的保护作用。 方法：将BALB/c小鼠分为PBS+PBS（对照组），PBS+MSCs（干细胞对照组），LPS+PBS（模型组），LPS+MSCs（治疗组），每组6只老鼠。10%水合氯醛（3ml/kg）腹腔注射麻醉，在麻醉状态下行气管插管术，PBS+PBS组、PBS+MSCs组和LPS+PBS组、LPS+MSCs组分别给予30μl PBS和30μl LPS（5mg/kg）。1h后PBS+MSCs组和PBS+MSCs组经气管插管给70μl HUC-MSCs悬液（1x106/只），PBS+PBS和LPS+PBS组经气管插管给PBS（70μl/只）。分别在HUC-MSCs给入后第1、3、5d，处死收集肺组织标本，观察肺组织病理改变并进行炎症评分，计算肺组织湿/干重比(W/D)。 结果：经气管插管给予LPS构建的ALI模型组，与对照组比较，HE染色结果表明炎症浸润明显、肺泡间隔增厚、肺出血严重及表现肺组织水肿的W/D的增加，表明ALI构建模型成功。HUC-MSCs治疗ALI模型改善了小鼠死亡率，缓解其缺氧状态，肺组织病理学观察可见ALI+MSCs组第3，5d处理组肺泡及支气管周围炎症细胞明显减少、肺泡间隔缩小、肺泡间隙出血明显减轻。肺组织病理评分评价在HUC-MSCs治疗ALI模型第3d对对肺泡阻塞程度、肺泡间隔厚度、肺水肿程度有明显统计学差异（P＜0.05)。 结论：经气管给予LPS可以成功构建ALI模型，HUC-MSCs可以 减轻ALI小鼠模型肺组织损伤程度，改善水肿对ALI小鼠模型具有保护作用。 第三部分人脐带间充质干细胞治疗急性肺损伤模型的机制初探 目的：探究HUC-MSCs对急性肺损伤模型的免疫调节作用，明确HUC-MSCs治疗急性肺损伤模型的分子机制。 方法：DAPI标记HUC-MSCs，气管插管给HUC-MSCs后示踪其在肺组织的分布及转移。将BALB/c小鼠分为PBS+PBS组，PBS+MSCs组，LPS+PBS组，LPS+MSCs组，每组6只老鼠。分别在HUC-MSCs给入后第1、2、3d处死小鼠收集BALF标本。对肺泡灌洗液炎性细胞计数及分类计数并测定BALF中总蛋白含量，检测肺组织中髓过氧化物酶MPO活性。蛋白芯片检测LPS+PBS组与LPS+MSC组BALF中308种蛋白表达。筛选表达有差异蛋白并用ELISA方法验证BALF中炎症因子的表达。 结果：DAPI可以高效率的标记HUC-MSCs，气管插管5h后HUC-MSCs可在肺组织中均匀分布，24h后逐渐减少。LPS+MSC组与LPS+PBS组相比BALF中细胞总数降低，中性粒细胞比例下降，MPO含量减少，蛋白芯片结果显示INF-γ、TLR4、MCP-1、GM-CSF、IL-6、TNF-α、IL-1β明显降低，VEGF有所增高，ELISA检测BALF中IL-6、IFN-γ因子减少。 结论：HUC-MSCs在肺组织24h后开始减少，对ALI模型的治疗作用主要通过其庞分泌作用，分泌炎症因子，影响炎症细胞发挥作用。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329
【图文】：

镜下采集图像。1.2.6 统计方法运用 SPSS 17.0 软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（X±s）表示，两组之间均数比较采用 t 检验；以 P<0.05 为差异有统计学意义。2 结果2.1 人脐带间充质干细胞形态学原代培养细胞约 24 h 内贴壁生长，培养 96 h 后在倒置显微镜下观察可见脐带组织碎块周围有三角形和成纤维样贴壁细胞出现，培养 12 d 后，细胞融合度达到80-90%，细胞呈成纤维细胞样漩涡式生长，经过连续传代 10 次，细胞变为形态更为均一的成纤维样细胞，细胞形态无明显改变、无衰老。

重庆医科大学硕士研究生学位论文-MSCs 的增殖能力3 代和 P10 代 HUC-MSCs MTT 增殖实验结果绘制细胞 P3 代和 P10 代 HUC-MSCs 增殖速度较快，2d 后进入对数细胞生长平台期，细胞生长停滞。两组之间差异无统计学意C-MSCs 10 代以内的连续传代不会影响细胞增殖能力。

图 1-3 流式细胞术检测 hUC-MSCs 细胞表面标志物Fig.1-3 Flow cytometry was used to detect cell the surface marker of HUC-MA CD34 B CD45 C CD73 D CD90 E CD105 F HLA-DRDF B

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 金发光;;急性肺损伤的诊治研究现状及进展[J];中华肺部疾病杂志(电子版);2013年01期

本文编号：2775616