长时程心室颤动犬病理生理变化及缝隙连接蛋白调节剂ZP123的干预研究

发布时间：2020-09-30 01:58

　　研究背景目前,心源性猝死已成为威胁人类生命的重要疾病,心室颤动是心源性猝死的主要原因。随着心室颤动持续时间的延长,心肺复苏的成功率迅速下降。复苏指南明确指出,心脏停搏后每耽搁1分钟,生存率下降6-10%。表明心室颤动的治疗效果与其持续时间关系密切,长时程室颤预后极差,复苏时间是影响生存率的关键因素。研究表明：除对患者尽早进行心肺复苏外,根据室颤的不同阶段,选择不同的治疗策略对生存率的改善有重要意义。Weisfeldt M等通过对大量临床复苏结果回顾分析后,提出心室颤动的三阶段理论,其三阶段包括：1：电学阶段：心室颤动发生后4分钟内; 2.循环节段：心室颤动发生后4-10分钟；此阶段血液循环出现障碍,影响心肌供血3.代谢阶段,心室颤动10分钟以后,机体出现代谢紊乱。并且认为心室颤动在不同的阶段,对治疗的反应不同,即存在不同的治疗窗口。在电学阶段,首选直流电除颤治疗；在循环阶段,先行有效的心肺复苏再行电除颤较先行电除颤后行心肺复苏将提高复苏率;而到代谢阶段后,两种治疗措施效果都不理想。目前对室颤不同阶段的病理生理机制仍未完全明了。有研究认为,电学阶段,机体处于代偿状态,直接电除颤最为有效；在循环阶段,先行心肺复苏有利于提供有限的血液循环,从而保证一定量的氧气和营养物质供应,并带走一部分因为缺血而产生的有害的代谢产物,有利于降低室颤的除颤阈值,提高除颤成功率。而到代谢阶段时,由于毒性代谢产物的聚集,高能磷酸键的消耗殆尽,血流淤滞造成凝血系统的激活,以及心肺复苏所致再灌注损伤,均使得复苏率急剧下降。提示在此阶段应注重综合治疗,可见,对室颤所致内环境病理机制的理解决定了治疗策略的选择和预后的改善。正确有效的心肺复苏是心室颤动抢救成功的关键。据报道,目前可有30-40%的心室颤动患者恢复自主循环,但长期存活率仅有10～30%。初期心肺复苏成功的患者往往存在复苏后心功能不全,此常为心肺复苏初期成功的患者仍有较高死亡率的重要原因。有关室颤复苏后心功能不全的机制已有不少研究。心室颤动复苏后的病理生理变化过程与缺血再灌注损伤相似。缺血再灌注发生后,激活体内多种生物活性物质信号转导途径如氧自由基增加,钙超载,炎症因子TNF-α、IL-6等释放,进而促进多种活性蛋白酶合成增加,加剧心肌损伤。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)与基质金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitors of metalloproteinase,TIMPs)参与了多种心血管疾病的发生发展过程。除了对细胞外基质的合成与代谢起着重要的调节作用,MMP-9还可以裂解肌球蛋白重链,进而破坏心肌整体收缩装置。近期研究表明MMPs与TIMPs也参与了急性的病理生理过程如血小板的聚集、血管张力的调节、炎症反应以及缺血再灌注损伤。有研究表明心肌发生缺血再灌注10min时,可发现心肌组织TIMP-1减少,MMP-9表达增多以及活性的增强,同时TIMP-1的减少与MMP-9活性的增强与左室功能降低有一定的相关性。心肺复苏后心肌再灌注产生的多种炎症细胞因子及活性氧自由基等均可调节MMPs和TIMPs的表达。目前对于室颤复苏后心功能的下降与MMP-9和TIMP-1变化关系的研究未见报道。我们实验的目的在于研究犬心室颤动的持续过程中生理生化过程的连续性变化,从病理生理机制方面寻找其内在规律,以指导临床治疗；通过心室颤动复苏后动物模型研究TIMP-1与MMP-9的表达变化以及对心室颤动复苏后心功能的影响。研究目的：1.通过对长时程心室颤动犬体内生理和生化过程的变化进行研究,试图从病理生理方面揭示室颤发生发展的内在规律；2.通过心室颤动复苏动物模型研究TIMP-1与MMP-9的表达变化；3.研究TIMP-1与MMP-9的表达变化对心室颤动复苏后心功能的影响。研究方法：1.心室颤动动物模型的构建和分组成年犬30只,(体重13.5-18.5kg),随机分为3组,假手术组(n=10),8min室颤组(n=10)和12min室颤组(n=10)。以3%戊巴比妥纳30mg/kg腹腔内麻醉成功后,仰卧位固定,肢体去毛后粘贴三导联电极,外联多导电生理仪以取得体表心电图信号。穿刺股动、静脉,置压力导管于升主动脉根部和右心房,外接Powerlab型八道生理记录仪监测压力变化及取血样用。穿刺心尖部皮下植入双向致颤电极,以30V,60Hz交流电诱发心室颤动。当1.心电图显示室颤波形2.主动脉压力失去波动,降至30mmHg以下即为室颤模型成功建立。观察期12min。假手术组除不致颤外,余同致颤组处理。2.各组动物的生理生化指标、心功能及心肌TIMP-1和MMP-9浓度的监测2.1.血流动力学参数连续记录室颤前、室颤发生后12分钟内及复苏后犬主动脉收缩压(aortic systolic pressure, AOSP)、主动脉舒张压(aortic diastolic pressure, AODP)、主动脉压力(aortic pressure, AOP)和右房压(right atrial pressure, RAP)。冠脉灌注压(coronary perfusion pressure, CPP)为AODP与RAP的差值,室颤后复苏前为AOP与RAP的差值。以心室颤动后每个时间点后20秒内测量压力的平均值作为该时间点主动脉压力数值。2.2.血液生化、血气分析及凝血/抗凝系列指标在心室颤动前,室颤后每隔1min取动静脉血,动脉血取得后立即行血气分析测定,测定其动脉血氧分压(Arterial oxygen partial pressure, PaO2)、二氧化碳分压(Carbon dioxide partial pressure)、动脉血pH值、乳酸浓度等指标；静脉血取得后应用血液生化仪测定肌酸激酶、肌酸激酶同工酶、肌钙蛋白、血清钾离子、钠离子、氯离子、钙离子浓度等血液生化指标,凝血／抗凝系列指标则包括纤维蛋白原(Fibrinogen, Fb)、抗凝血酶Ⅲ(antithrombin-Ⅲ, AT-Ⅲ))、和D-二聚体(D-Dimer)浓度。2.3.超声心动图测量动物致颤前和恢复自主循环1小时后行胸二维超声分别测量致颤前,ROSC后左房内径(left atrium dimension, LAD),左室舒张期内径(left ventricular diastolic dimension, LVDd)和左室射血分数(left ventricular ejection fraction, LVEF)2.4.心肌TIMP-1和MMP-9测定室颤维持8min或12min后,进行心肺复苏和电除颤。免疫组化和Western Blot技术检测假手术组、心室颤动8min组、12min组复苏成功犬心肌TIMP-1和MMP-9的水平。3.统计学分析所用数据用SPSS17.0统计软件进行分析。数值变量资料数据以均数±标准差(x±s)表示,两组间均数比较采用小样本t检验,多组间均数比较采用One-Way ANOVA方差分析,以P0.05为差异有统计学意义。结果：实验过程中,30只犬中。26只一次诱发心室颤动成功,4只二次诱发心室颤动成功,均持续12min。复苏后8min室颤组和12min室颤组分别有7只和5只动物恢复自主循环。1各组动物基础状态各项指标比较实验前各组动物的体重,心率,左心房内径、左心室内径、左室射血分数以及血流动力学、血气分析、凝血指标和血生化指标均无显著性差异。2室颤后各项生理生化指标2.1血流动力学参数在室颤发生后5分钟内,主动脉内压持续下降,与室颤前相比,下降具有统计学意义,P0.05；右心房压力在心室颤动的第一分钟内升高,在以后的4分钟内逐渐下降,于5分钟时逐渐稳定；冠状动脉灌注压迅速下降。于5分钟下降至基线,之后无明显改变。冠脉灌注压代表了心肌供血状态。2.2血液生化指标与室颤前相比,血肌酸激酶、肌酸激酶同工酶、肌钙蛋白、血清钾离子、钠离子、氯离子、钙离子浓度均未取得统计学差异。2.3血气分析指标心室颤动后,动脉血Pa02逐渐降低,心室颤动5分钟后,与室颤前相比有统计学差异。PaCO2逐渐升高,与室颤前相比无统计学差异。血清乳酸含量逐渐升高；心室颤动6分钟后,与室颤前相比有统计学差异。动脉血pH值逐渐下降,心室颤动8分钟后,与室颤前相比有统计学差异。2.4凝血/抗凝系列指标心室颤动后,纤维蛋白原浓度持续下降,于5分钟时与室颤前相比有统计学差异(2.56 mg/ml vs.2.32 mg/ml, P=0.031);抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)浓度持续下降,于室颤8分钟后出现统计学差异(105.08 ug/ml vs.89.69 ug/ml, P=0.027)。血浆D-二聚体(D-Dimer)持续上升,于12分钟时出现统计学差异(0.291 ug/ml vs.1.129 ug/ml, P=0.035)。3动物恢复自主循环后血流动力学和心功能情况3.1血流动力学8min室颤组和12min室颤组分别有7只和5只动物恢复自主循环。与致颤前比较,恢复ROSC后的动物血流动力学参数降低(P0.05)3.2超声测量心脏结构和功能指标的变化左心结构的改变：致颤前各组之间LVIDs及LVIDd均无显著性差异(P0.05)；与致颤前相比,室颤组动物左房、左室内径扩大(P均0.05)。12min室颤组左房扩大程度明显高于8mmin室颤组(P0.05)左室收缩功能的评价：致颤前各组动物间LVEF的变化均无显著差异(P0.05)。复苏后测量,与致颤前相比,各室颤组动物LVEF明显下降(P均0.05)。12min室颤组LVEF下降的程度明显高于8min室颤组(P0.05)4心室颤动复苏后TIMP-1和MMP-9的表达变化随着室颤时间的延长和相应的心肺复苏后TIMP-1逐渐减少(P0.05),MMP-9的表达无显著性差异(P0.05),但其表达量逐渐增加,室颤组TIMP-1与MMP-9的比值(TIMP-1/MMP-9)明显低于假手术组(P0.05)5.MMP-9和TIMP-1与心功能的关系TIMP-1的水平与LAD负相关(r=一0.83；P0.05),与LVDd呈负相关(r=一0.96,P0.05),与LVEF呈正相关(r=0.85,P0.05),即随着TIMB-1的逐渐减少LAD, LVDd逐渐增大,LVEF逐渐降低。研究结论：1.长时程心室颤动的病理过程呈现阶段性变化,渐次出现血流动力学障碍,酸碱平衡紊乱,凝血和继发性纤溶亢进；2.室颤复苏后存在TIMP-1和MMP-9的表达失衡,此失衡可能与心功能的降低相关。研究背景：心室颤动(ventrichular fibrillation,VF室颤)是导致心脏性猝死最常见的心律失常之一。室颤的发生机理多数是在基础心脏疾患的基础上,心肌组织产生多个折返中心,由这些折返中心形成多个不协调的冲动,向心室各个方向不均匀传导所致。多折返是室颤产生与维持的重要机制。目前治疗室颤的有效方法是非同步电除颤,而长时程室颤致血流动力学障碍,心肌缺血进行性加重,内环境紊乱,进一步造成细胞间电传导异常,使得室颤转复率明显下降,并且转复后不易维持正常心律,除颤阈值及除颤次数均增加,高能量除颤带来的结果并不理想。以细胞膜离子通道为作用靶点的传统抗心律失常药物对改善除颤效果不佳。相邻细胞间的正常通讯通过细胞间的缝隙连接(gap junction, GJ)实现,缝隙连接由不同类型的缝隙连接蛋白(Connexin, Cx)构成。病理状态下如心肌缺血、纤维化时,心肌细胞间缝隙连接的大小、数量、密度及空间分布发生变化,从而使心肌细胞间电位失耦联、传导速度减慢、各向异性比率改变,细胞间的冲动传导受到阻碍,心脏电复极不一致,易于形成折返,为发生各种类型的心律失常提供了基质。Cx43作为构成心室肌缝隙连接的主要蛋白,在多种心血管疾病的发生、发展中的作用逐渐被重视。在心肌缺血、缺氧、酸中毒状态下,Cx43去磷酸化增加,降解增加,并向细胞内迁移,在细胞膜表面表达减少,引起缝隙连接功能的紊乱,电传导各向异性增加,导致心律失常的发生。即使没有明显的心脏结构损伤,Cx43表达减少或缺如,也会导致致命性心律失常。缝隙连接蛋白调节剂ZP123是一种新型的抗心律失常肽,可通过调节缝隙连接蛋白的表达起到抗心律失常的作用。有研究发现,心室肌细胞经ZP123预处理后,可防止酸中毒诱导的细胞间缝隙连接蛋白Cx43的失耦联,减少去磷酸化比例及细胞内迁移,恢复正常电传导。还有研究表明ZP123可以使缝隙连接的传导速度增加69%。可以促进缺血心室肌细胞间的电耦联,预防折返性室性心动过速的发生。与传统抗心律失常药物不同,ZP123不影响细胞膜离子通道,无致心律失常的副作用,因此近年来成为研究的热点。我们先前对于4分钟兔心室颤动模型研究证实,ZP123可以降低心室颤动除颤能量,然而在长时程心室颤动过程中,ZP123对不同阶段心室颤动影响有待于研究。本研究检测了Cx43在心室颤动不同阶段表达与分布的变化,评估经缝隙连接蛋白调节剂ZP123预处理后,其对不同时程心室颤动除颤能量、除颤成功率和自主循环恢复率的影响。研究目的：1.根据前述心室颤动的临床和生化阶段,评估Cx43在心室颤动不同阶段表达与分布的变化；2.缝隙连接蛋白调节剂ZP123在室颤不同阶段对缝隙连接蛋白Cx43的影响；3.观察ZP123对不同时程室颤除颤能量及除颤成功率的影响；4.评价ZP123对不同时程室颤复苏率的影响。研究方法：1.实验动物随机选取健康成年家犬60只,雌雄不限,体重13.5-18.5kg,随机分为五组。分组情况：药物组8min(n=10只)：麻醉,气管插管,ZP123 1μg/kg静推+10μg·kg-1·h-1泵入30分钟,致颤8分钟,予心肺复苏,成功后开胸取心肌；药物组12min(n=15只)：麻醉,气管插管,ZP123 1μg/kg静推+10μg·kg-1·h-1泵入30分钟,致颤12分钟,予心肺复苏成功后,开胸取心肌；常规复苏组8min(n=10只)；常规复苏组12min(n=15只)(除药物以生理盐水替代外,余同药物组处置);假手术组(n=10只)：不致颤,余同常规复苏组。2.室颤模型的构建3%戊巴比妥钠(30mg/kg)耳缘静脉静注麻醉,气管插管,连接呼吸机,在SIMV模式下调整呼吸机参数为：潮气量10—15m1/kg体重,呼吸频率16—20次/分,吸入氧浓度(Fi02 50%—80%),吸气与呼气时间比为1：1.5-2.0,呼气末正压为5cmH20 (0.49Kpa)。多导电生理记录仪监测心电图。体外除颤器监测血氧饱和度(Sa02),分别测量基础状态及达到自主循环恢复后的心率、PR间期、OT间期,校正的QT间期(QTc)以Bazett's公式计算得出。分别穿刺股动、静脉,分别将压力导管送入升主动脉根部和右心房,在X线下确定导管位置,并连于多导电生理记录仪,监测与记录主动脉压力和右房压力。将体外电刺激器火线端与零线端的导电针头分别插入心前区左上方与右下方的皮下,以80V持续刺激5S可以成功的诱发持续室颤。室颤成功的标准：(1)心电图示室颤波形；(2)主动脉压力失去波动,降至30mmHg以下。根据论文一结果将研究阶段定为心室颤动后8min和12min。室颤维持8min或12min后给予心肺复苏和电除颤。3.心肺复苏室颤模型成功建立后,即撤除呼吸机,待室颤持续8min和12min后,立即开始胸外心脏按压,同时接气囊,按压通气比为30：2,5个复苏周期即2分钟后,进行心律评估,仍为室颤的给予双向非同步电除颤,根据预实验结果将首次除颤能量为70J,若未能终止,则将除颤能量依次递增为100J、150J,以后的能量均为150J。每次电除颤前均给予2mmin的心肺复苏。待5个复苏周期后进行血流动力学和心律评估,如此循环。复苏过程中视情况给予肾上腺素、阿托品等药物。复苏终点为动物恢复自主循环(restoration of spontaneous circulation, ROSC),定义为主动脉收缩压80mmHg至少持续1min,或抢救达30min未达到自主循环恢复者放弃。达到自主循环恢复的动物立即给予高级生命支持,并观察1小时。4.血流动力学指标及心电图参数记录室颤前及心肺复苏后的各项血流动力学指标：主动脉收缩压(aortic systolic pressure, AOSP)、主动脉舒张压(aortic diastolic pressure, AODP)、主动脉平均压(aortic mean pressure, AOMP);右心房收缩压(right atrial systolic pressure, RASP)、右心房舒张压(right atrial diastolic pressure, RADP)、右心房平均压(right atrial mean pressure, RAMP),冠状动脉灌注压(主动脉舒张压减右心房舒张压,coronary perfusion pressure, CPP)。记录室颤前及心肺复苏后的心电图参数：心率,PR间期,校正的QT间期5.平均除颤能量、除颤成功率和自主循环恢复率记录室颤心肺复苏过程中各组动物的平均除颤能量(各组动物复苏成功后总除颤能量／复苏成功动物只数)、各除颤能量级除颤成功率(70J、100J、150J)和自主循环恢复率,并加以分析比较。6.免疫荧光及激光共聚焦显微镜存活时间达到一小时的动物用10%氯化钾处死,迅速开胸,沿左心室长轴留取0.5cm3大小的左心室游离壁心肌组织数块,一部分用4%多聚甲醛固定用于免疫荧光分析,另一部分放入液氮中速冻然后转存至-80℃冰箱冻存,用于Western-Blot分析。4%多聚甲醛固定心室肌组织24小时后取出,石蜡包埋后于切片机上切成4gm厚的组织切片,石蜡切片脱蜡至水,以枸橼酸盐缓冲液微波修复抗原15min,5%正常山羊血清封闭20分钟后,滴入1：100稀释的Cx43多克隆抗体4℃过夜,再滴加1：500稀释的IgG-FITC二抗,37℃孵育30分钟后,缓冲甘油封片。在德国Leica公司TCS SP2型激光扫描共聚焦显微镜下观察,用488nm波长蓝光激发FITC,发生光为519nm绿光。每张切片至少取四个视野,逐层扫描以获取清晰图像。将获取的图像去除背景,留下标准的荧光染色部分以供分析。以Image-Pro Plus 6.0软件分析荧光强度并计算当前视野下Cx43面积百分比及积分光密度。7. Western-Blot分析提取蛋白,上样,行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。待电泳结束后,把目的蛋白转至PVDF膜上。后将PVDF膜放入5%脱脂奶粉(TBST)稀释室温封闭2小时,滴加1：500稀释的Cx43多克隆抗体4℃过夜后,再滴加二抗(1：10000)室温孵育2小时,以增强化学发光法显色,X光片曝光显影,用凝胶成像分析系统QuantityOne摄像分析,测定目的蛋白与内参蛋白(β-actin)的灰度值,将二者的比值作为Cx43的表达水平进行比较。8.统计学分析实验获得所有数据以均数x±s表示,用SPSS17.0统计软件进行统计分析,统计方法采用单因素方差分析(one-way ANOVA), P0.05为差异有统计学意义。研究结果：1.犬的一般状况各组动物基础状态无统计学差异；8min药物组有8只动物达自主循环恢复并存活1小时,8min常规复苏组有6只动物达自主循环恢复并存活1小时。12min药物组有5只动物达自主循环恢复并存活1小时,12min常规复苏组有4只动物达自主循环恢复并存活1小时。2.各组动物达到ROSC后血流动力学参数以及心电图参数比较室颤模型建立成功后,于8min和12min后进行心肺复苏和非同步电除颤,记录分析各组动物达到ROSC后血流动力学参数以及心电图参数,结果显示：各组动物达到ROSC后的血流动力学参数总体之间无差异(P0.05)。心电图参数总体之间无差异(P0.05)3.各组动物平均除颤能量、除颤成功率和自主循环恢复率8min组：药物组平均除颤能量明显低于常规复苏组(427.2±126.4J vs.560.7±128.9J,P=0.045),各能量级除颤成功率均明显高于常规复苏组(70J:60% vs.40%,P0.05；100J:75% vs55%,P0.05；150J:85% vs.70%,P0.05).自主循环恢复率与8min常规复苏组有统计学意义(80% vs.66%,P0.05)。12min组：药物组动物的除颤能量明显低于12min常规复苏组,(538.5±130 Jvs.695.5±149 J,P0.05),各能量级除颤成功率明显高于常规复苏组(70J:40% vs. 20%,P0.05； 100J:60% vs.30%,P0.05；150J:75% vs.45%,P0.05).自主循环恢复率与常规复苏组无显著差异(33% vs.25%,P0.05)。4.免疫荧光结果假手术组Cx43荧光信号强,形态清晰,分布均匀,排列有序；常规复苏组Cx43荧光信号弱,形态模糊,排列紊乱,呈现不均一分布;药物组Cx43的荧光信号较强,形态相对清晰,不均一分布的程度较常规复苏组减轻。图象定量分析显示8min常规复苏组Cx43荧光信号的面积百分比以及积分光密度值明显低于假手术组,差异有统计学意义(1.31±0.07 vs.1.86±0.06； 14800±1772 vs.19600±2160,P0.05):8min常规复苏组的Cx43荧光信号的面积百分比以及积分光密度值明显低于8min药物组,差异有统计学意义(1.31±0.07 vs.1.72±0.05；14800±1772 vs.17200±1903,P0.05)。12min常规复苏组Cx43荧光信号的面积百分比以及积分光密度值明显低于假手术组,差异有统计学意义(1.02±0.06 vs.1.86±0.06；7100±1352 vs.19600±2160,P0.05)；12min常规复苏组的Cx43荧光信号的面积百分比以及积分光密度值明显低于12min药物组,差异有统计学意义(1.02±0.06vs.1.41±0.06；7100±1352 vs.11200±1650,P0.05)。12min药物组Cx43荧光信号的面积百分比以及积分光密度值明显低于假手术组,差异有统计学意义(1.41±0.06 vs.1.86±0.06；11200±1650Vs.19600±2160,P0.05)5.Western-Blot结果：图像定量分析显示,8min常规复苏组Cx43表达水平(0.75±0.07)较假手术组(1.07±0.04)及8min药物组Cx43表达水平(0.95±0.06)明显减少,差异有统计学意义(P0.05)；12min常规复苏组Cx43表达水平(0.58±0.05)较假手术组(1.07±0.04)及12min药物组Cx43表达水平(0.75±0.06)明显减少,差异有统计学意义(P0.05)。12min药物组Cx43表达水平(0.75±0.06)低于假手术组,差异有统计学意义(P0.05)。研究结论：1.长时程心室颤动犬心室肌缝隙连接蛋白Cx43数量随心室颤动的维持进行性减少；2.ZP123可防止长时程心室颤动犬心室肌Cx43数量的减少,不受室颤时程的影响；3.ZP123可以降低不同时程室颤的除颤能量,提高除颤成功率；4.ZP123可以改善8min犬心室颤动复苏率,可能与降低室颤除颤能量提高除颤成功率有关。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R541.7
【部分图文】：

室颤,血流动力学参数,统计学意义,统计学

在室颤发生后５分钟内，主动脉席（ＡＰ）持续ｒ降，４宝颤起始时相比，ｈ＇降具有统计学逡逑意文，伴＜０．０５；右屯、房尿力（ＲＡＰ）在也宝颤动的第１分钟内升高，在Ｗ后的４分钟内逐逡逑渐下降，干５分钟时逐渐稳定；Ｍ状动豚灌注拓（ＣＰ巧迅速ｒ降。于５分钟ｒ降至基线。与逡逑基础值相比，下降具巧统计学意义。巧＜０．０５逡逑

长时程心室颤动犬病理生理变化及缝隙连接蛋白调节剂ZP123的干预研究

表示ZP123是AAP10的反转类似

室颤,血流动力学参数,统计学意义,统计学

【共引文献】