氟对调控骨与胰岛素相关性影响

发布时间：2017-04-10 16:20

  本文关键词：氟对调控骨与胰岛素相关性影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景： 成骨细胞当处于慢性氟中毒状态时是如何被激活的，胰岛素与骨组织如何受氟的调控从而导致病理过程进行，这两点是地方性氟中毒发病机制中有价值的研究问题。本实验拟从体外、体内两方面进行探究，具体是通过体外培养成骨细胞染氟，同时配合整体氟中毒动物实验，观察氟中毒对氧化应激（SOD、MDA、GPX等）的变化影响，同时检测氟化物对动物模型的血糖、血脂、血钙以及血清胰岛素的含量影响，分析成骨细胞增生、分化和骨形成与其之间的相互关系；检测与成骨细胞增殖、分化等相关的基因表达和调控因子的变化。本实验的完成有助于发现氟对于调控骨组织与胰岛素的内在相关性，为氟骨症及相关并发症的防治策略提供思路和理论依据。 实验方法： 动物实验：Wistar大鼠100只，分配成对照组、低氟组和高氟组3组，保证各组间体重基本一致。给氟方式为灌胃，溶液配制方法为：双蒸水配置NaF,定浓度2.21g/L，相当于100mgF-/ml。低氟组大鼠按照每天10mg F-/kg体重给氟，高氟组大鼠每天20mg F-/kg体重给氟，对照组通过灌胃给以双蒸水。在进行投氟1、2和3月之后，将大鼠分别经乙醚麻醉，采血、分离血清以备生化检测。同时，选取一侧大鼠股骨经10%EDTA脱钙，常规脱水、石蜡包埋、制作病理切片，HE染色和免疫组化；再选取取另一侧股骨提取总RNA进行相关基因的表达分析。 CCK-8检测MC3T3-E1细胞体外增殖活性：MC3T3-E1细胞植入96孔板，分别设为实验组和对照组，每组剂量梯度均为0、0.1、1.0、2.0、4.0、8.0、16mgF-/L，各共7组不同氟浓度组。实验组在染氟基础上，每孔各加入50nmol/L胰岛素进行干预。每组设8个复孔，采用CCK-8法检测细胞增殖活性。依据受干预细胞的活性变化趋势，选取具有代表性的低、中、高剂量氟干预的成骨细胞。取24孔培养板，将细胞植入其中，分为对照组及2.0、8.0和20mg F-/L3个不同氟浓度组，采用免疫荧光技术，实现对不同染氟条件下成骨细胞InR变化的检测。提取细胞RNA进行实时PCR定量，分析成骨相关基因的表达变化。 实验结果： 动物实验结果：通过灌胃给氟方式成功复制了氟骨症特征性病变。运用形态学、免疫荧光技术和实时定量聚合酶链式反应，观察到胰岛素及相关转录因子、生化因子和细胞因子在不同浓度氟作用于成骨细胞功能改变发生机制中参与反应。通过氟中毒大鼠骨组织成骨相关的基因考察结果，证明氟中毒大鼠氟骨症呈特征性的骨吸收活跃到成骨活跃的骨转换加强病变特征。 细胞实验结果：成骨细胞在氟的干预下具有双向效应，即低剂量氟刺激细胞活性，而高剂量氟抑制细胞活性。成骨相关基因在染氟成骨细胞内的表达变化呈双向性特征，即低氟条件下升高，但在高氟条件下降低。 实验结论： 本项目通过灌胃方式给氟，准确复制出骨形成加速的病变特征的氟中毒大鼠骨病变。投氟后ALP、Runx2表达增强，而胰岛素受体和IGF-Ⅰ表达变化与ALP和Runx2变化类似，提示胰岛素受体和IGF-Ⅰ参与了在氟促成骨作用的机制。 早期氟并未造成明显氧化应激，投氟后期引起了氧化应激轻度失代偿，，说明氧化应激在早期氟刺激骨转换过程作用不明显。投氟各组大鼠相关胰岛素异常而受影响的血糖和血脂等代谢指标在代偿范围内，说明氟对胰岛的影响并未造成机体的代谢异常。 细胞实验证实胰岛素与氟联合应用后成骨细胞明显增生，并且低、中剂量氟直接诱导成骨细胞表面胰岛素受体的表达，提示了胰岛素信号通路对氟诱导成骨机制中的可能作用。 氟刺激成骨作用的同时伴随着胰岛素分泌增强和骨组织或成骨细胞相关胰岛素受体等表达增多，证明在氟诱导成骨作用机制中，胰岛素增强对其产生了较大的影响。
【关键词】：氟化物 氟骨症 胰岛素 胰岛素受体
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R599.1
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-13
• 中英文缩写词对照表13-14
• 第一篇 文献综述14-30
• 第一章 骨对胰岛素的影响14-19
• 1.1 胰岛的内分泌和外分泌功能14
• 1.2 胰岛分泌的几种激素14-15
• 1.3 胰岛素的特征15-16
• 1.4 骨钙素的特征16-17
• 1.5 骨钙素受体 GPRC6A 的特征17
• 1.6 骨钙素对胰岛素的影响17-19
• 第二章 胰岛素对骨的影响19-26
• 2.1 骨结构19
• 2.2 骨细胞种类19-21
• 2.3 骨基质21-22
• 2.4 胰岛素对骨的调控22-26
• 2.4.1 InR 与 IRS22-23
• 2.4.2 IGF-Ⅰ23-24
• 2.4.3 PI3K24-25
• 2.4.4 Ras25-26
• 第三章 氟中毒病区人群的骨病变与胰岛素分泌的变化调查26-30
• 3.1 氟化物26-27
• 3.2 氟中毒病区概况27-28
• 3.3 慢性氟中毒时的骨转换28
• 3.4 氟中毒病区胰岛素分泌变化28-30
• 第二篇 实验研究30-51
• 第一章 材料与方法30-40
• 1.实验材料30-33
• 1.1 实验对象30
• 1.1.1 实验动物30
• 1.1.2 染氟小鼠 MC3T3-E1 成骨细胞系：30
• 1.2 主要试剂30-31
• 1.3 主要仪器与设备31-32
• 1.4 器械耗材32-33
• 1.5 主要应用软件33
• 2.实验方法33-40
• 2.1 制备氟中毒动物模型33
• 2.2 骨组织病理学检测33-35
• 2.2.1 组织的固定、脱钙和切片33-34
• 2.2.2 常规 HE 染色34
• 2.2.3 免疫组化34-35
• 2.3 氟中毒大鼠骨组织相关基因的表达分析35-37
• 2.3.1 骨组织总 RNA 提取35
• 2.3.2 逆转录反应35-36
• 2.3.3 聚合酶链式反应36
• 2.3.4 引物合成36-37
• 2.4 氟中毒大鼠血清氧化应激水平37-38
• 2.5 血糖、血脂、血钙及血清胰岛素的含量变化38
• 2.6 CCK-8 检测 MC3T3-E1 细胞体外增殖活性38-39
• 2.6.1 实验原理38
• 2.6.2 实验分组38-39
• 2.6.3 实验步骤39
• 2.7 胰岛素受体免疫荧光39-40
• 2.7.1 实验分组39
• 2.7.2 实验步骤39-40
• 第二章 实验结果40-51
• 1.1 大鼠的基本特征40
• 1.2 骨组织病理学检测40-41
• 1.2.1 骨组织切片染色40-41
• 1.3 大鼠股骨成骨相关基因的表达41-42
• 1.4 大鼠股骨细胞骨钙素、胰岛素受体与胰岛素样生长因子的表达42-43
• 1.5 大鼠血清氧化应激水平变化43-44
• 1.6 投氟不同时间大鼠胰岛病理和功能变化44-47
• 1.7 大鼠血糖、血脂、血钙与血清胰岛素水平变化47-48
• 1.8 氟对 MC3T3-E1 细胞增殖活性的影响48-49
• 1.9 胰岛素受体免疫荧光49-51
• 第三篇 讨论和结论51-54
• 一、讨论51-52
• 二、结论52-54
• 参考文献54-62
• 作者简介及科研成果62-63
• 致谢63

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 边建朝,咸树梅,叶平,刘永平,刘传蛟,纪庆宪,王学松,刘源,李平春,相有章,丁伟,王琳,范崇法;氟中毒患者体内微量元素、抗氧化物质、脂类及其相互关系[J];中国地方病防治杂志;1993年06期

2 官志忠;杨沛施;刘尚安;苏玉水;;氟中毒对大鼠肝、脑组织中脂质过氧化物和超氧化物歧化酶的影响[J];贵阳医学院学报;1990年03期

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本文编号：297120