交泰丸镇静催眠作用的靶标代谢组学研究

发布时间：2017-04-16 05:29

  本文关键词：交泰丸镇静催眠作用的靶标代谢组学研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：课题来源：国家自然科学基金面上项目《基于“脑微透析-药动学／药效学”的交泰丸“配伍生新”机制研究》(基金项目编号：81173564)目的：采用脑微透析技术采样,研究给药交泰丸后正常大鼠和对氯苯丙氨酸(PCPA)诱导的失眠模型大鼠海马组织的神经递质的动态变化。利用靶标代谢组学的方法,研究交泰丸对PCPA诱导的大鼠失眠模型的干预作用,探讨交泰丸镇静催眠作用的作用机制。方法：1.建立同时测定脑微透析样品中单胺类神经递质及其代谢物的LC-MS/MS方法建立同时测定脑微透析样品中多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)、5-羟色胺(5-HT)、3,4-二羟基苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)、3-甲氧基-4-羟基苯乙二醇(MHPG)和5-羟基吲哚乙酸(5-HIAA)七个神经递质的LC-MS/MS方法。采用丹磺酰氯(DNS)作为衍生化试剂,对衍生化的条件进行优化；优化色谱、质谱条件,对方法的专属性、线性范围、精密度、准确度和稳定性进行考察。2.交泰丸对正常大鼠和PCPA诱导的失眠模型大鼠海马组织神经递质的动态影响用水合氯醛麻醉大鼠,切开大鼠头皮,用颅骨钻打孔。然后利用大鼠脑立体定位仪,将导管植入大鼠大脑海马组织中(AP:-5.2mm,ML:+4.5 mm;DV:-3.8 mm),并用螺丝和牙科水泥固定导管。大鼠恢复7天后,把导管的芯取出,将探针通过导管植入到海马组织中。将大鼠置于大鼠清醒装置,连接好泵。用人工脑脊液以2 μL/min的流速灌注,平衡2 h,开始取样,共取4个样,作为神经递质基础水平测定的样品。然后灌胃给药交泰丸,剂量为黄连提取物300 mg/kg,肉桂油4.7 mg/kg。药物混悬于0.5%的羧甲基纤维素钠中。给药后继续收集样品,每15 min收集一个样品,共收集10h。收集的样品全部保存于-80℃冰箱。样品按照已经建立的测定方法测定神经递质的浓度。然后分析数据,得出结论。3.建立同时测定氨基酸、单胺类神经递质和嘌呤嘧啶的亲水色谱串联质谱(HILIC-MS/MS)方法针对内源性物质极性大的特点,采用HILIC-MS/MS的方法对24种氨基酸、4种神经递质和8中嘌呤嘧啶进行含量测定。分别比较在乙腈和正常大鼠血清、乙腈和正常大鼠脑组织匀浆液作为基质的标准曲线的斜率,考察采用乙腈作为基质配制标准曲线样品是否合理。对色谱质谱条件进行优化,对方法的线性范围、精密度、准确度、加样回收率进行考察。4.交泰丸对PCPA诱导的失眠模型大鼠干扰的靶标代谢组学研究将18只大鼠随机分为3组,正常组,PCPA模型组,PCPA模型给药组。PCPA模型组和PCPA模型给药组在第1天腹腔注射PCPA 300mg/kg,在第2天和第3天,注射腹腔PCPA100 mg/kg,复制PCPA失眠模型。第4天开始,PCPA模型给药组灌胃给予交泰丸,正常组和PCPA模型组给予相应体积的0.5%的CMC-Na溶液。实验第7天,在给药6小时后,取血0.5mL,放置30min后,5000 rpm离心10min,分离血清,立刻放置-80℃保存,待测。在第10天,给药6小时后,用腹腔注射水合氯醛(300 mg/kg)麻醉大鼠,取血清,然后断头处死大鼠,在冰台迅速分离脑组织,脑组织立刻放置-80℃保存。血清样本和脑组织样本采用已经建立的方法进行测定。利用SIMCA-P+(version 12.0,Umetrics,Umea, Sweden)进行PCA和PLS-DA多元统计分析,结合T检验筛选出差异的代谢物。将发现的差异代谢物,用Metabo Analyst 3.0进行代谢通路分析,进一步结合HDMB、KEEG等数据库解析差异代谢物的生物学意义。结果：1.建立了同时测定脑微透析样品中DA、NE、5-HT、DOPAC、HVA、MHPG和5-HIAA的LC-MS/MS。其样品衍生化的条件温和,反应时间短。方法的专属性、线性范围、精密度、准确度和稳定性符合生物样品分析方法的要求；方法快速、灵敏,适合微透析样品中单胺类神经递质及其代谢物的分析。2.本研究采用活体脑微透析采样技术,研究了交泰丸对正常大鼠和PCPA诱导的失眠模型大鼠的多种神经递质的动态影响。结果显示,交泰丸影响了海马组织细胞间的多种神经递质的代谢。其影响主要是在一定时间内增加了神经递质及其代谢物的浓度。3.建立了包括氨基酸、神经递质和嘌呤嘧啶共37化合物的HILIC-MS/MS方法。方法的线性范围、精密度、准确度、加样回收率符合生物样品分析方法的要求。其方法样品处理简单,灵敏度高,分析时间短,适合用于交泰丸治疗PCPA诱导的失眠模型大鼠的靶标代谢组学研究。4.模型组和给药组的血清中5-HT浓度明显低于正常组血清中5-HT的浓度,PCPA模型复制成功。交泰丸对PCPA模型大鼠的干扰作用与逆转PCPA导致的代谢紊乱有关,主要与作用可能与下调苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的代谢、多巴胺代谢、谷氨酸谷氨酰胺代谢等代谢通路有关。此外,还可能与对甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、组氨酸代谢和精氨酸和脯氨酸代谢的影响有关。然而,交泰丸不影响PCPA模型大鼠的5-HT代谢通路,其对PCPA的治疗作用与5-HT代谢通路无关。结论：微透析技术和代谢组学技术可以应用于交泰丸的药理作用研究；单次给药交泰丸可以增加大鼠海马组织的单胺类神经递质及其代谢物的浓度,其起效时间快,持续时间在6h左右；药交泰丸可以改善PCPA导致的代谢紊乱,主要与与下调苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的代谢、多巴胺代谢、谷氨酸谷氨酰胺代谢等代谢通路有关。
【关键词】：交泰丸 神经递质 靶标代谢组学 失眠 液质联用
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R285.5
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-11
• 引言11-12
• 第一章 文献研究12-19
• 1.1 交泰丸药理研究进展12-14
• 1.2 神经递质与睡眠的关系14-15
• 1.3 神经递质测定方法研究进展15-16
• 1.4 微透析在中药研究中的应用16-17
• 1.5 代谢组学在中药研究的应用17-19
• 第二章 建立同时测定脑微透析样品中单胺类神经递质及其代谢物的LC-MS/MS方法19-28
• 2.1 前言19
• 2.2 仪器与材料19
• 2.2.1 仪器19
• 2.2.2 对照品和试剂19
• 2.3 方法19-21
• 2.3.1 对照品溶液的配制19-20
• 2.3.2 样品衍生化处理20
• 2.3.3 色谱和质谱条件20
• 2.3.4 方法学验证20-21
• 2.4 结果与讨论21-27
• 2.4.1 样品处理21-23
• 2.4.2 色谱质谱条件优化23-25
• 2.4.3 方法学验证结果25-27
• 2.5 结论27-28
• 第三章 交泰丸正常大鼠和PCPA诱导的失眠模型大鼠海马组织神经递质的动态影响28-32
• 3.1 前言28
• 3.2 仪器与材料28
• 3.2.1 仪器28
• 3.2.2 试药28
• 3.2.3 动物28
• 3.3 方法28-29
• 3.3.1 黄连提取物和肉桂油的制备28-29
• 3.3.2 导管植入手术29
• 3.2.3 PCPA模型复制29
• 3.2.4 活体微透析采样29
• 3.4 结果与讨论29-32
• 第四章 建立同时测定氨基酸、单胺类神经递质和嘌呤嘧啶的HILIC-MS/MS方法32-46
• 4.1 前言32
• 4.2 仪器与材料32
• 4.2.1 仪器32
• 4.2.2 对照品和试剂32
• 4.3 方法32-35
• 4.3.1 对照品溶液和内标溶液的配制32-33
• 4.3.2 色谱和质谱条件33-35
• 4.3.3 方法学验证35
• 4.4 结果与讨论35-45
• 4.4.1 方法的建立35
• 4.4.2 色谱质谱条件优化35-38
• 4.4.3 质谱参数优化38-39
• 4.4.4 方法学验证结果39-45
• 4.5 结论45-46
• 第五章 交泰丸对PCPA模型大鼠干预的靶标代谢组学研究46-59
• 5.1 前言46
• 5.2 仪器与材料46
• 5.2.1 仪器46
• 5.2.2 对照品和试剂46
• 5.2.3 试药46
• 5.2.4 动物46
• 5.3 方法46-47
• 5.3.1 动物实验47
• 5.3.2 样品处理与测定47
• 5.3.3 数据处理47
• 5.4 结果与讨论47-59
• 5.4.1 PCPA模型复制评价47-48
• 5.4.2 多变量统计分析结果48-50
• 5.4.3 代谢差异物识别50-55
• 5.4.4 差异代谢物生物学意义解析55-59
• 结语59-60
• 参考文献60-66
• 在校期间发表论文情况66-67
• 致谢67-68
• 附件168

【参考文献】

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本文编号：310129