抗菌肽LL-37对大鼠鲍曼不动杆菌感染创面抗菌作用的初步研究

发布时间：2017-05-01 02:03

  本文关键词：抗菌肽LL-37对大鼠鲍曼不动杆菌感染创面抗菌作用的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景：随着全球经济的快速发展,交通事故、社会冲突以及自然灾害的发生越来越频繁,机体创伤的发生有增无减。皮肤作为人体抵御病原菌入侵的第一道屏障,一旦遭到严重创伤(烧伤、烫伤等),某些病原菌就会趁机入侵并定植,导致感染及并发症的发生。临床创伤常见病原菌有铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌等。董叶丽等对自2005-2010年收治的1235例创伤并发创面感染的病原学调查中,鲍曼不动杆菌的检出率为7.70%,更重要的是,鲍曼不动杆菌的耐药率有明显的上升趋势,尤其是对碳青霉烯类的耐药性日益升高。鲍曼不动杆菌属于非发酵革兰阴性杆菌,是一种条件致病菌,广泛分布于自然界,是人体皮肤、呼吸道、胃肠道的正常菌群。该菌在医院环境中分布很广且可长期存活,对重症监护室病房和烧伤病房中的患者威胁很大,可导致各种严重的感染性疾病,其危险因素包括重症监护护理、住院时间长、使用机械通气、应用侵入性操作技术、广谱抗菌药物使用、长时间使用免疫抑制剂及合并严重的基础疾病等。由于鲍曼不动杆菌具有快速获得和传播耐药性的能力,且耐药机制极为复杂,加之临床上大量使用广谱抗菌药物,特别是第3,4代头孢菌素和碳青酶烯类在临床上的广泛应用,为其耐药性的产生和发展创造了有利的条件。口前鲍曼不动杆菌几乎对所有临床使用的抗菌药物耐药,可形成耐多种抗菌药物的鲍曼不动杆菌,包括多重耐药鲍曼不动杆菌、泛耐药鲍曼不动杆菌及全耐药鲍曼不动杆菌。根据中国细菌耐药性监测结果显示,于2010-2013年间,鲍曼不动杆菌临床检出率为16%左右,对亚胺培南及美罗培南的耐药率均在60%左右。而我国西南医院从478例烧伤患者中分离得到了2748株致病菌,分析显示鲍曼不动杆菌占14.37%,仅次于铜绿假单胞菌(36.24%)及金黄色葡萄球菌(18.01%),鲍曼不动杆菌对包括碳青霉烯类在内的绝大部分抗生素的耐药率在57.91%-100.00%之间,且呈逐年增加的趋势,文中结论表示鲍曼不动杆菌可能取代铜绿假单胞菌成为导致烧伤感染患者死亡的主要致病细菌。正是因为近些年来耐药鲍曼不动杆菌逐渐增多、耐药性增强,临床上急需寻找新的抗鲍曼不动杆菌药物。抗菌肽(Antibacterial peptide,ABP)由生物体免疫防卫系统产生,是抗外源性病原体致病作用的防御性多肽活性物质,是生物体固有免疫的重要组成部分,该物质广泛分布于各种动植物体内。大量研究表明,LL-37是迄今为止在人类Cathelicidins家族中发现的唯一成员,主要由中性粒细胞、各种上皮细胞等产生,具有广谱、高效的抗微生物活性,其抗菌谱包括G+、G-菌、真菌以及部分有包膜的病毒,还有中和内毒素、免疫调节、诱导血管生成、促进损伤修复等生物学功能。目前,尚未见有关局部应用抗菌肽LL-37对鲍曼不动杆菌感染创面作用的相关报道,也尚未见关于制备大鼠深Ⅱ度烫伤创面鲍曼不动杆菌感染模型的文献报道,故本研究先探索、建立大鼠深Ⅱ度烫伤创面鲍曼不动杆菌感染模型,另外建立大鼠皮肤切除创面鲍曼不动杆菌感染模型,再分别与磺胺米隆做阳性对照,初步评价LL-37对烧伤及创伤创面鲍曼不动杆菌感染的抗菌作用,为进一步研究提供有益的参考。目的：1、检测抗菌肽LL-37对鲍曼不动杆菌的最小抑菌浓度(MIC)及最小杀菌浓度(MBC)；2、建立大鼠深Ⅱ度烫伤创面鲍曼不动杆菌感染模型；3、初步观察局部应用抗菌肽LL-37对鲍曼不动杆菌感染大鼠烫伤创面的抗菌效果。4、初步观察局部应用抗菌肽LL-37对鲍曼不动杆菌感染大鼠皮肤创伤创面的抗菌效果。方法：1、测定LL-37对鲍曼不动杆菌的MIC及MBC：采用微量肉汤稀释法,操作规范参照美国临床实验室标准化委员会(CLSI)标准(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)。2、建立大鼠深Ⅱ度烫伤创面鲍曼不动杆菌感染模型：选40只健康Wistar成年大鼠(南方医科大学实验动物中心),实验前一天先用80g/L硫化钠将大鼠背部脱毛。用2%戊巴比妥钠(0.2ml/100g)腹腔注射麻醉后,以85℃水浴烫伤背部无毛区15s,制成深Ⅱ度烫伤创面,面积约3cmx2cm。烫伤后10min于每只大鼠创面上均匀涂抹制备的鲍曼不动杆菌菌液(含菌量为1×108 CFU/ml)0.5ml,创面包扎,分笼喂养在清洁、干燥、室温为(24±5)℃的实验室内。于涂布后12h、24h、48h、72h分批处死大鼠,每批随机选择处死10只,无菌条件下切取痂下组织,每次切取组织大小约1cmx1cm,将痂下组织剪碎后,按100mg组织加入0.9ml等渗盐水的比例进行匀浆,匀浆后作为10-1稀释度,再将匀浆液进行梯度稀释后接种于琼脂平板上,置于37℃温箱中孵育24h,计算每克组织的菌落克隆形成单位,每克组织细菌含量(CFU/g)=菌落数(CFU)x稀释倍数÷组织重量(g)。造模成功标准为痂下细菌定量达到1×105CFU/g。3、观察局部应用抗菌肽LL-37对大鼠烫伤创面鲍曼不动杆菌感染的抗菌效果：另选72只健康Wistar成年大鼠,按前述方法建立大鼠烫伤模型及创面感染模型。随机分为抗菌肽组、磺胺米隆组、生理盐水对照组(以下简称对照组),每组24只。各组分别用含0.2g/L抗菌肽LL-37溶液、100g/L磺胺米隆溶液、生理盐水的4层纱布湿敷,再用无菌纱布包扎,每天换药一次。给药后1-7d大体观察大鼠精神、进食及活动情况及创面渗出情况；大鼠分别在给药后1d、3d、5d、7d处死,每组每批随机选择处死6只,无菌条件下切取皮肤组织块,深达肌层,大小为1cm×1cm,行病理组织切片检查,观察炎性细胞浸润情况。另切取痂下肌肉组织一块,大小约1cm×1cm,然后用稀释涂布平板法计算菌数。4、观察局部应用抗菌肽LL-37对鲍曼不动杆菌感染大鼠皮肤创伤创面的抗菌效果：取30只健康Wistar成年大鼠,麻醉后,切除背部1.5cm×1.5cm大小的全层皮肤,将鲍曼不动杆菌菌液(含菌量为1×10 CFU/ml) 0.1ml涂抹于创面制成感染模型,并随机分为抗菌肽组、磺胺米隆组、生理盐水对照组(以下简称对照组),每组10只。伤后3h各组分别用含0.2.g/L抗菌肽LL-37溶液、100g/L磺胺米隆溶液或生理盐水的4层纱布湿敷,每天换药1次。伤后1-3d大体观察各组大鼠创面的情况；伤后3d处死大鼠,检测痂下组织细菌定量并行HE染色观察创面炎性细胞浸润情况。结果：1、测得LL-37对鲍曼不动杆菌的MIC及MBC分别为64μg/ml、128μg/ml。2、创面细菌鉴定结果为鲍曼不动杆菌。大鼠深Ⅱ度烫伤后10min接种含菌量约为1×108 CFU/ml的鲍曼不动杆菌菌液0.5ml,接种后12h、24h、48h、72h分别测得痂下细菌为0.09×105cfu/g、0.77×105 cfu/g、2.16×105 cfu/g、7.17×105 cfu/g。3、抗菌肽LL-37对鲍曼不动杆菌感染大鼠烫伤创面的抗菌效果：所有实验大鼠至实验结束无1例死亡。用药前(即接种细菌后48h),三组大鼠创面大部分呈苍白色,局部有少许渗出,创缘红肿。抗菌肽组及对照组于3d时创面湿润,创面周围水肿；5d大部分创面仍湿润,局部形成红褐色痂皮,创缘红肿明显,痂下肉芽组织生长不佳,肌肉组织晦暗；7d创面较干燥,部分创面形成棕褐色痂皮,创缘水肿较前减轻,痂下可见肉芽组织生长。磺胺米隆组3d时创面干燥,部分创面可见棕褐色痂皮形成,5d时大部分形成棕褐色痂皮,创面稍缩小,痂下可见肉芽组织生长,7d时痂皮颜色加深、变硬,痂下肉芽组织生长良好。细菌定量结果显示治疗后各时间点抗菌肽组及对照组的细菌数均多于磺胺米隆组(P0.05),抗菌肽组与对照组之间各时间点细菌数均无统计学差异(P0.05)。磺胺米隆组1d至7d细菌数则呈逐渐递减趋势,抗菌肽组及对照组细菌数从伤后1d至5d逐渐增多,但7d时细菌数开始下降。HE染色显示用药后1d三组创面均可见弥漫浸润的中性粒细胞浸润,用药后3d、5d、7d磺胺米隆组的均较抗菌肽组及对照组轻,5d时磺胺米隆组真皮层及皮下有少许炎性细胞浸润,而抗菌肽组及对照组仍有大量炎性细胞浸润。4、抗菌肽LL-37对鲍曼不动杆菌感染大鼠皮肤创伤创面的抗菌效果：对照组大鼠相比其他两组活动减少,创面潮湿,分泌物较多；磺胺米隆组及抗菌肽组创面结痂、干燥、无明显分泌物。抗菌肽组细菌定量为(11.9±6.7)×102 CFU/g,磺胺米隆组为(15.2±11.4)×102 CFU/g,对照组为(68.1±36.4)×104 CFU/g,前两组明显低于对照组(P0.01),而抗菌肽组与磺胺米隆组无显著差异(P0.05)。HE染色显示三组大鼠创面均有明显的渗出物覆盖,对照组可见大量弥漫分布的中性粒细胞浸润,而磺胺米隆组及抗菌肽组中性粒细胞较对照组少。结论：1、LL-37对鲍曼不动杆菌的MIC及MBC分别为128μg/ml、128μg/ml。2、大鼠深Ⅱ度烫伤创面接种1×108 CFU/ml的泛耐药鲍曼不动杆菌菌液,48h后可作为大鼠烫伤创面感染模型(细菌定量1×105CFU/g)。3、抗菌肽LL-37局部应用对于鲍曼不动杆菌痂下浸润感染的大鼠深Ⅱ度烫伤创面无明显抗菌效果。4、抗菌肽LL-37局部应用对鲍曼不动杆菌感染的大鼠皮肤创伤创面有明显的抗菌作用。
【关键词】：抗菌肽 LL-37 鲍曼不动杆菌 烧伤 创面感染
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R446.5
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 第一章 序言15-23
• 第二章 抗菌肽LL-37对深Ⅱ度烫伤大鼠鲍曼不动杆菌感染创面的抗菌作用23-34
• 2.1 前言23
• 2.2 实验材料23-25
• 2.3 实验方法25-28
• 2.4 结果28-30
• 2.5 讨论30-34
• 第三章 抗菌肽LL-37对大鼠鲍曼不动杆菌感染创伤创面的抗菌作用34-43
• 3.1 前言34
• 3.2 实验材料34-35
• 3.3 实验方法35-36
• 3.4 结果36-38
• 3.5 讨论38-43
• 全文总结43
• 研究展望43-45
• 参考文献45-53
• 攻读学位期间成果53-54
• 中英文缩略词表54-55
• 致谢55-56

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 马序竹;吕媛;;鲍曼不动杆菌对主要抗菌药物耐药机制[J];中国临床药理学杂志;2009年01期

2 张蔚;孙丰南;费建文;;内原性抗菌肽CAP18/LL37的研究进展[J];国际呼吸杂志;2006年09期

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本文编号：337989